本文關(guān)鍵詞：孤獨癥易感基因NRXN1突變體蛋白的生物學(xué)功能研究

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【摘要】：背景：孤獨癥譜系障礙(Autism Spectrum Disorder, ASD)簡稱孤獨癥,又稱自閉癥,是一種嚴(yán)重的兒童精神發(fā)育障礙疾病,主要表現(xiàn)為語言溝通和社會交往障礙,并伴有狹隘興趣和重復(fù)刻板行為,通常3歲前發(fā)病。孤獨癥的病因?qū)W和發(fā)病機(jī)制尚未被闡明,而其診斷只能依靠行為學(xué)的觀察。研究顯示,一些影響神經(jīng)發(fā)育的基因,比如與突觸發(fā)生和突觸可塑性相關(guān)的一些基因是孤獨癥易感基因。Neurexins(以下簡稱NRXNs)是一類特異表達(dá)于哺乳動物大腦的細(xì)胞粘附分子,而NRXN1是近年來研究得最廣泛的孤獨癥易感基因之一。NRXN1表達(dá)在突觸前膜,與突觸后膜的一些粘附分子相互作用,在突觸的形成、成熟以及神經(jīng)傳遞中起重要作用。在前期研究中我們在孤獨癥患者中鑒定了三個NRXN1錯義突變Y315H、L933V和I1175V,本研究針對這三個錯義突變構(gòu)建表達(dá)載體,分析了NRXN1突變型蛋白在亞細(xì)胞定位、降解途徑、蛋白穩(wěn)定性等生物學(xué)功能上的改變,探討了這三個位于α-NRXNl的變異的可能的致病機(jī)理。 方法：為研究在孤獨癥患者中發(fā)現(xiàn)的NRXN1的三個錯義突變Y315H、L933V、I1175V對NRXN1蛋白功能的影響,進(jìn)而探討其在孤獨癥發(fā)病中的影響,我們構(gòu)建了NRXN1野生型和突變型的表達(dá)載體,篩選了表達(dá)NRXN1野生型和突變型蛋白的HEK293穩(wěn)定細(xì)胞系,對這些蛋白的分布、穩(wěn)定性和降解途徑進(jìn)行了分析,從而初步闡明這幾個錯義突變對NRXN1生理功能的影響以及對突觸的影響。通過與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志蛋白的免疫熒光染色,對NRXN1野生型及突變型蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了研究；用蛋白酶體抑制劑MG132和溶酶體抑制劑CQ阻斷蛋白質(zhì)降解的可能的途徑,確定了NRXN1野生型和突變型蛋白在細(xì)胞內(nèi)的降解途徑；用CHX抑制細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成,確定了蛋白質(zhì)的降解速率。 結(jié)果：對三個錯義突變進(jìn)行生物學(xué)功能分析發(fā)現(xiàn),三個突變體蛋白在HEK293細(xì)胞中呈胞漿分布和膜分布,與NRXN1野生型蛋白無明顯差別；蛋白質(zhì)的降解主要通過自噬溶酶體途徑,與野生型沒有差別；突變體NRXN1-Y315H的降解速率相對于野生型蛋白有所減慢,NRXN1-L933V降解速率有所加快,而NRXN1-I1175V降解速率與野生型蛋白無明顯差別。 結(jié)論：上述結(jié)果表明,在孤獨癥患者中發(fā)現(xiàn)的三個錯義突變的相關(guān)突變蛋白的表達(dá)、修飾、轉(zhuǎn)運、亞細(xì)胞定位在非神經(jīng)源性的細(xì)胞HEK293中與野生型沒有差別,但是突變Y315H和L933V可能影響了NRXN1蛋白的降解過程。
【關(guān)鍵詞】：孤獨癥 NRXN1 突變體 功能研究
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R749.94
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 英文詞縮略表8-10
• 前言10-14
• 1 主要儀器、試劑與耗材14-18
• 1.1 主要實驗儀器14-15
• 1.2 主要實驗試劑及耗材15-18
• 2. 實驗方法18-31
• 2.1 保守性分析18
• 2.2 質(zhì)粒的構(gòu)建18-23
• 2.2.1 試劑的配制18-19
• 2.2.2 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化19-20
• 2.2.3 構(gòu)建質(zhì)粒20-23
• 2.3 NRXN1-HEK293穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的篩選23-30
• 2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)23-24
• 2.3.2 轉(zhuǎn)染24-25
• 2.3.3 鑒定方法25-30
• 2.4 NRXN1蛋白的亞細(xì)胞定位30
• 2.5 NRXN1野生型蛋白和突變型蛋白生化特性的測定30-31
• 2.5.1 蛋白質(zhì)半衰期的確定30
• 2.5.2 降解途徑的確定30-31
• 3. 實驗結(jié)果31-38
• 3.1 保守性分析結(jié)果31
• 3.2 載體構(gòu)建質(zhì)粒測序結(jié)果31-32
• 3.3 NRXN1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系鑒定結(jié)果32-33
• 3.4 NRXN1野生型及突變型蛋白的亞細(xì)胞定位33-36
• 3.5 蛋白質(zhì)半衰期36-37
• 3.6 蛋白質(zhì)降解途徑37-38
• 4. 分析與討論38-39
• 5. 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-42
• 綜述42-55
• 參考文獻(xiàn)49-55
• 攻讀學(xué)位期間主要的研究成果55-56
• 致謝56-57
• 個人簡歷57

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 楊曙光;胡月璋;韓允;;兒童孤獨癥的流行病學(xué)調(diào)查分析[J];實用兒科臨床雜志;2007年24期

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本文編號：1099938