本文關(guān)鍵詞：血液提取總RNA方法的優(yōu)化及其在支氣管肺發(fā)育不良患兒血液內(nèi)TLK1表達(dá)的應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： TRIZOL法 全血RNA 支氣管肺發(fā)育不良 TLK1 Real-Time PCR

【摘要】：研究背景 在臨床上，已有多種針對疾病的輔助檢查,其中通過血液的檢查占多數(shù)，血液檢查具有操作簡便、標(biāo)本易取及對被檢查者創(chuàng)傷相對較小的優(yōu)點(diǎn)，但也存在一些缺點(diǎn)，如操作頻繁易引起感染、取血量過多可導(dǎo)致貧血等。對于早產(chǎn)兒而言，各臟器功能發(fā)育不成熟，生理功能發(fā)育不完善，骨髓造血功能薄弱，過早地停止了胎內(nèi)的骨髓外造血因而不能適應(yīng)生后機(jī)體快速生長發(fā)育，體內(nèi)鐵儲存少等，導(dǎo)致早產(chǎn)兒貧血非常常見；并且由于早產(chǎn)兒針對感染、黃疸、電解質(zhì)紊亂等疾病，血液檢查多，抽血頻繁，大量的采血可進(jìn)一步導(dǎo)致貧血。嚴(yán)重的貧血可導(dǎo)致呼吸暫停、生長障礙、營養(yǎng)缺乏，易并發(fā)感染等。通過血液樣本做的檢查方法包括生化、培養(yǎng)及致病基因的檢測等，而基因檢測則需要通過提取血液中的RNA得出檢驗(yàn)結(jié)果。血液RNA的提取方法多種多樣，包括試劑盒法、傳統(tǒng)TRIZOL法及SDS法等。這些方法各有利弊，臨床上通過何種方法提取血液RNA效果最好，目前尚無明確定論，值得我們開展研究，用于篩選臨床血液提取RNA的最佳方法。 支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasias，BPD），以往又稱為新生兒慢性肺病（chronic lung disease，CLD），是早產(chǎn)兒、特別是小早產(chǎn)兒呼吸系統(tǒng)常見疾病，是嬰兒期慢性呼吸系統(tǒng)疾病的主要原因。近年來，隨著早產(chǎn)兒救治技術(shù)的不斷增高，BPD的發(fā)生率也隨之增加，嚴(yán)重影響著早產(chǎn)兒的存活率及生長發(fā)育狀態(tài)。目前支氣管肺發(fā)育不良已越來越被重視，現(xiàn)已成為新生兒學(xué)科熱門的學(xué)術(shù)研究。絲氨酸/蘇氨酸蛋白擾動樣激酶1（Tousled-like Kinase1，TLK1），又稱PKU-beta，是蛋白激酶家族和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的核心蛋白，首先被發(fā)現(xiàn)于花和葉子的組織中，之后也被廣泛發(fā)現(xiàn)于人體的各個組織內(nèi)。在細(xì)胞周期S期的調(diào)節(jié)激酶中，TLK1作用最大。TLK1具有參與染色體分離、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、蛋白氨基酸磷酸化及應(yīng)答DNA損傷修復(fù)的功能，TLK1也參與多種信號通路，在機(jī)體的各種反應(yīng)中起著重大的作用。據(jù)研究，在乳腺癌、前列腺癌、膽管癌及肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)TLK1存在高度表達(dá)。研究目的 1.本課題旨在研究改進(jìn)提取血液RNA的方法，通過本研究在確保RNA的完整性的情況下，達(dá)到降低臨床患兒的取血量的目的，更有利于保護(hù)患兒、保證臨床實(shí)驗(yàn)的完成。 2.鑒于TLK1具有應(yīng)答損傷修復(fù)功能，而支氣管肺發(fā)育不良患兒長期受機(jī)械通氣及吸氧的損傷及修復(fù)，肺組織及血液內(nèi)TLK1的表達(dá)可能不同于其他無長時間損傷修復(fù)的患兒。本課題擬采用實(shí)時定量熒光PCR（Real-Time PCR）技術(shù)定量檢測支氣管肺發(fā)育不良患兒血液標(biāo)本內(nèi)TLK1的含量，旨在初步探討支氣管肺發(fā)育不良患兒體內(nèi)TLK1表達(dá)的情況。研究方法 1.以TRIZOL法為基本研究方法，通過分別提取等量全血、血漿及血清的總RNA，選擇總RNA提取量最多的一種血液標(biāo)本；隨后，對不同血液量所提取的總RNA進(jìn)行比較，得出最佳的實(shí)驗(yàn)取血量。 2.將上述抽取血液RNA的實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)用于臨床標(biāo)本檢測，并對此方法進(jìn)行驗(yàn)證：以來源于本院極早產(chǎn)新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房（極早產(chǎn)NICU）內(nèi)診斷為BPD的18名患兒抽取的靜脈血為研究對象，根據(jù)病例組病例患兒的基本信息，以10名近胎齡、近似日齡的非BPD患兒抽取的靜脈血為對照，分別采用TRIZOL法提取RNA，并采用反轉(zhuǎn)錄PCR（ReversedTranscript PCR）方法對所抽提的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。運(yùn)用Real-Time PCR方法對BPD患兒血液TLK1產(chǎn)物做定量分析，采用△△Ct法，以GVPDH為內(nèi)參，以非BPD患兒組為對照。結(jié)果 1.計(jì)算并通過比較TRIZOL法，在等量（0.1ml）全血、血漿及血清提取的總RNA的得率和質(zhì)量分別為：全血提取RNA得率為（232.2904±58.42103）、純度為（1.7421±0.6920），血漿提取RNA得率為（142.0728±45.24386）、純度為（1.4765±0.5418），血清提取RNA的率為（198.7496±51.47629）、純度為（1.5833±0.6257），因此，全血提取的總RNA的得率明顯優(yōu)于血清及血漿，總RNA的純度也最高； 2.以不同的全血量通過不同劑量的TRIZOL提取總RNA比較，在0.1-1ml的全血量的范圍內(nèi)，以適量的TRIZOL提取的總RNA的量，全血量越多，提取的RNA的得率及純度越高，但是，全血量越多，提取完整總RNA所需TRIZOL量越多，將不利于后期實(shí)驗(yàn)操作，因此選取最佳的全血量進(jìn)行提取血液RNA的實(shí)驗(yàn)對患者及后期實(shí)驗(yàn)研究非常重要。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以0.3ml的全血量及1mlTRIZOL即可得到完整的總RNA量，且純度也能達(dá)到1.8-2.0這一標(biāo)準(zhǔn)值，臨床取血量相對較少，是最佳的實(shí)驗(yàn)取血量； 3.以上述實(shí)驗(yàn)全血量（0.3ml）及實(shí)驗(yàn)方法對支氣管肺發(fā)育不良組及對照組共28個樣本提取RNA，除1個樣本外，，其余27個樣本提取的總RNA的得率及純度均在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，證明此提取血液RNA的實(shí)驗(yàn)方法有效； 4.對所有樣本中TLK1的含量進(jìn)行Real-Time PCR定量分析，再運(yùn)用t檢驗(yàn)、△△Ct法等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法做出分析，結(jié)果表明，支氣管肺發(fā)育不良組TLK1的表達(dá)高于非支氣管肺發(fā)育不良組。結(jié)論 1.等量的全血獲得的總RNA的得率及純度最高，0.3ml全血及1mlTRIZOL即可滿足實(shí) 驗(yàn)需要； 2.BPD患兒靜脈全血內(nèi)TLK1的表達(dá)高于非BPD組。相對于非支氣管發(fā)育不良患兒， 支氣管肺發(fā)育不良患兒體內(nèi)TLK1表達(dá)增高。
【關(guān)鍵詞】：TRIZOL法 全血RNA 支氣管肺發(fā)育不良 TLK1 Real-Time PCR
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R722.6
【目錄】：

• 英文縮略詞表4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-14
• 參考文獻(xiàn)12-14
• 第一部分 血液提取總 RNA 方法的優(yōu)化14-20
• 材料與方法14-16
• 結(jié)果16-18
• 討論18
• 參考文獻(xiàn)18-20
• 第二部分 血液提取總 RNA 方法改進(jìn)后的臨床應(yīng)用20-33
• 材料與方法20-27
• 結(jié)果27-30
• 討論30-32
• 參考文獻(xiàn)32-33
• 綜述33-38
• 參考文獻(xiàn)35-38
• 作者簡介38-39
• 致謝39

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 呂娜;張玲;劉寧;;提取血液總RNA兩種方法的比較和分析[J];東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2008年08期

2 邱方;陳子祥;楊清玉;劉晨;董亮;李星;;不同方法提取血清總RNA的性能評價[J];國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2012年04期

3 譚繼英,關(guān)泉林,汪曉煒,高明太,史大中,袁文臻;乳腺癌患者外周血RNA提取方法的探討[J];蘭州醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2002年04期

4 于柏峰;劉玲麗;;少量外周血提取RNA方法的研究[J];中國熱帶醫(yī)學(xué);2010年10期

5 王玲;朱翠平;呂回;;TGF-β_1、siRNA對BPD模型鼠肺損傷的干預(yù)研究[J];臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2008年05期

6 宮磊;李鐵臣;孔麗娜;;全血中直接抽提RNA方法的探討[J];皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2006年02期

7 林玲;楊燕凌;何海福;汪世華;;總RNA提取方法的比較與分析[J];武夷科學(xué);2009年00期

8 陳志;羅衛(wèi)星;劉若余;石照應(yīng);王祿超;張依裕;蔡惠芬;;血液提取總RNA的初步研究[J];中國農(nóng)學(xué)通報;2012年05期

本文編號：1062833