本文關鍵詞：應用微陣列芯片技術分析先天性巨結腸miRNAs表達譜差異

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【摘要】：研究背景先天性巨結腸(Hirschsprung disease, HSCR)又稱腸無神經(jīng)節(jié)細胞癥,是一種由腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常而導致的大腸先天性畸形,其病理特征是腸壁肌間及黏膜下神經(jīng)叢神經(jīng)節(jié)細胞卻如。HSCR為常見的小兒消化道畸形之一,發(fā)病率約為1：5000,居消化道畸形的第二位,其在亞洲人群的發(fā)病率較高。目前關于先天性巨結腸發(fā)病機制的較一致的觀點認為：胚胎早期階段微環(huán)境改變及遺傳學因素在巨結腸發(fā)病中發(fā)揮著重要作用,即HSCR由遺傳及環(huán)境因素共同作用所致。目前,已發(fā)現(xiàn)的與先天性巨結腸發(fā)病密切相關的基因有許多種,例如RET、GDNF、NRTN、ECE1、EDN3、SOX10、PHOX2B、NRG1等。近年來對HSCR的基因研究有了顯著進步,研究者1992年第一次報道了一例10號染色體長臂(10q)中間缺失的全結腸型HSCR患兒,并進一步證實它位于10q11.2和10q21.2之間,最后研究者于1994年證實了先天性巨結腸患兒存在RET基因突變。RET原癌基因在神經(jīng)嵴細胞中廣泛表達,是一種具有絡氨酸激酶活性的跨膜受體,對維持腸神經(jīng)元的發(fā)育至關重要,功能實驗證實RET基因敲除后可導致鼠全部消化管壁內神經(jīng)節(jié)細胞的缺如,因此,RET基因在先天性巨結腸的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。作為與RET基因互補的GDNF基因也被發(fā)現(xiàn)在HSCR患者中存在基因突變。EDNRB的表達伴隨胚胎發(fā)育的整個過程,它的功能是使神經(jīng)嵴細胞發(fā)育至成熟的神經(jīng)節(jié)細胞,在動物實驗中靶向破壞EDNRB基因,可以導致腸管出現(xiàn)無神經(jīng)節(jié)細胞。而與其相應的配體EDN3的基因突變也被證實在HSCR形成過程中發(fā)揮著重要的作用,有人報道了66例散發(fā)性及9例家族性HSCR病例的EDN3基因檢測結果,在外顯子2發(fā)現(xiàn)了一種新的雜合性突變,這種發(fā)生過早的框架移動突變會導致兩個區(qū)域停止編碼,其結果是產(chǎn)生無功能的基因產(chǎn)物。SOX10也被證實是HSCR的易感基因,它在胚胎期表達于神經(jīng)嵴細胞,參與外周神經(jīng)系統(tǒng)的形成,檢測發(fā)現(xiàn)很多HSCR患兒存在SOX10基因突變。上述研究表明,基因在神經(jīng)嵴干細胞的分化及移行過程中發(fā)揮著重要的作用,基因缺陷可明顯干擾神經(jīng)嵴細胞的移行及分化。眾所周知,腸神經(jīng)嵴細胞會快速地遷移至腸管及在腸壁內橫向移動,而且,腸神經(jīng)嵴細胞亞群在腸壁內移行的過程中會進行神經(jīng)分化,以形成神經(jīng)叢。腸神經(jīng)嵴細胞在腸道的定植是神經(jīng)細胞增殖、遷移及分化過程的完美統(tǒng)一,動物模型中,若神經(jīng)細胞的數(shù)量、遷移行為或者分化比例受干擾時會發(fā)生先天性巨結腸。微小RNA (MicroRNAs, miRNA)為由21-25個核苷酸構成的非編碼短序列單鏈RNA分子,是一種內源性小分子RNA, miRNA能夠以堿基配對的形式與其靶基因mRNA分子的3’非編碼區(qū)(3'UTR)發(fā)生特異性結合,進而引發(fā)mRNA降解或者翻譯抑制,最終在轉錄后水平發(fā)揮基因調節(jié)作用。迄今,發(fā)現(xiàn)了上千種miRNAs,其通過調節(jié)ImRNA的表達而在多個生命過程中發(fā)揮著重要作用,包括細胞增殖、細胞凋亡、器官發(fā)育、應激反應及各種疾病形成等。miRNA對于神經(jīng)元的發(fā)育和正常功能的維持至關重要,miRNA:表達水平的動態(tài)變化在神經(jīng)發(fā)生、成熟及大腦的發(fā)育過程中發(fā)揮著調節(jié)作用。缺失Dicer的小鼠會出現(xiàn)大腦發(fā)育缺陷一不能發(fā)育為正常的神經(jīng)元形態(tài)、神經(jīng)萎縮、嚴重的生長缺陷及早期死亡。腸神經(jīng)系統(tǒng)作為周圍神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分,其所含的神經(jīng)元在數(shù)量上與脊髓中的含量相當,因此,miRNA可能與腸神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育也密切相關,而且有研究報道一些miRNAs參與腸神經(jīng)嵴細胞的分化、增殖、遷移及凋亡整個過程。而且,在發(fā)育過程中,miRNA會發(fā)揮正性和負性基因轉錄及轉錄后調節(jié)的協(xié)同作用,其結果是導致細胞多樣性的產(chǎn)生,而一旦這種協(xié)同效應發(fā)生障礙,就可能產(chǎn)生先天性發(fā)育異常,導致先天性疾病的發(fā)生。第一章應用微陣列芯片技術篩選先天性巨結腸組織的miRNA表達譜研究目的應用miRNA微陣列芯片技術檢測先天性巨結腸狹窄段與擴張段腸管組織差異表達的miRNAs,初步建立先天性巨結腸組織的miRNA表達譜。方法收集27例在南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院行手術治療的HSCR患兒的狹窄段及擴張段腸管組織,選取其中6例,使用TRIzol (Invitrogen)法提取組織總RNA,并用RNasey Mini Kit(QIAGEN)純化提取的RNA。使用NanoDrop ND-1000測量純化后的RNA濃度,電泳檢測RNA完整性。抽提的RNA通過質檢后,使用從丹麥Exiqon公司購買的miRCURYTM Array Power Labeling kit對miRNA進行標記,標記完成后,按照Exiqon公司提供的實驗方法將樣品與miRCURYTM LNA Array (v.18.0) (Exiqon)芯片雜交,使用Axon GenePix 4000B芯片掃描儀掃描芯片。使用GenePix Pro 6.0讀取芯片掃描圖像,并提取探針的信號值。相同的探針取中值合并。保留在所有樣品中均=30.0的探針,對全部芯片進行中值標準化,篩選差異表達探針。使用Fold change和P-value篩選兩組樣品間(有重復)的差異表達miRNA。使用Fold change篩選兩個樣品間(沒有重復)的差異表達miRNAs。結果總RNA質量鑒定結果：A260/A280比值均接近2.0,A260/A230比值均大于1.8,表明所有組織標本的總RNA質量可靠,沒有降解或其它雜質污染,如DNA、蛋白質等,可進行后續(xù)的微陣列芯片等實驗。miRNA微陣列芯片篩選結果表明,與擴張段腸管組織相比,狹窄段腸管表達上調超過2倍的miRNAs有19個(miR-3941, miR-K12-1-3p, miR-K12-3-3p, miR-145-3p等),表達下調超過2倍的有7個(miR-625-5p, miR-520g-3p, miR-1260a, miR-3916等)(P均0.05)。結論先天性巨結腸狹窄段及擴張段腸管組織之間存在顯著差異表達的miRNAs,這些顯著差異表達的miRNAs可能與先天性巨結腸的發(fā)病密切相關,為進一步揭示HSCR的發(fā)病機制提供了新的研究思路。第二章差異表達miRNAs的靶基因預測研究目的運用生物信息學軟件預測miRNAs靶基因,初步探索miRNA參與先天性巨結腸發(fā)生的機制。方法依據(jù)Fold Change值、P值及ForeGround值(理想值100)選擇出8個較為理想的miRNAs進行靶基因預測,首先,運用HSCR的主題詞于PubMed網(wǎng)站檢索,篩選出與HSCR發(fā)病相關的基因,然后采用Targetscan、miRTarBase、miRDB、 MicroRNA.org靶基因預測軟件分析顯著差異表達的miRNAs與先天性巨結腸相關基因之間的關系。結果選擇的8個顯著差異表達的miRNAs靶基因預測結果表明,除了miR-138-2-3p和miR-148a-3p,其余6個miRNAs與HSCR相關基因存在互補關系。 miR-193a-3p(1個靶基因)、miR-3646(5個靶基因)、miR-1260a(4個靶基因)、miR-4524b-5p(1個靶基因)、miR-145-3p(3個靶基因)、miR-4505(3個靶基因)。結論6個miRNAs與HSCR相關基因存在互補關系,這些miRNAs可能通過這些靶基因參與先天性巨結腸的發(fā)病。第三章應用實時熒光定量PCR技術驗證先天性巨結腸組織中差異表達的miRNAs研究目的對通過微陣列芯片實驗獲得的且與HSCR相關基因存在互補關系的差異表達的miRNAs,我們應用實時熒光定量PCR技術做進一步的驗證。方法對收集的27例在南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院行手術治療的HSCR患兒的狹窄段及擴張段腸管組織提取總RNA后,我們作進一步qRT-PCR驗證。采用SYBR(?)GreenI嵌合熒光法檢測miR-145-3p、miR-4505及miR-1260a的表達量。miRNA引物由特異性引物及Oligo(dT)-Universal Tag通用反轉錄引物構成。按照操作說明書進行RNA的反轉錄和實時熒光定量PCR反應：(1)2μg含有目的miRNA的總RNA,用miRcutemiRNA First-Strand cDNA Synthesis kit試劑盒在miRNA 3'末端加多聚A尾Poly (A),再使用Oligo(dT)-Universal Tag通用反轉錄引物進行逆轉錄反應,最終合成miRNA對應的cDNA第一鏈,反應條件為37℃,60min,95℃,5min,產(chǎn)物-20℃冰箱保存。(2)取2μlmiRNA第一鏈cDNA液,采用miRcute miRNA qPCR Detection kit(SYBR Green)試劑盒進行miRNA熒光定量檢測。PCR反應的條件為：94℃ 2min,1個循環(huán),94℃ 20s,60℃ 34s,45個循環(huán)。以U6為內參,進行歸一化。結果qRT-PCR證實不同組間miR-145-3p (1.42±0.42,狹窄段vs.0.90±0.31,擴張段)及miR-4505(1.30±0.30,狹窄段vs.0.76±0.22,擴張段)表達量具有統(tǒng)計學差異(P均0.001),且與HSCR分型有關(P=0.000),而miR-1260a(1.11±0.25,狹窄段vs.0.99±0.21,擴張段)的表達無明顯差異(P=0.064)。為了發(fā)現(xiàn)其他可能影響狹窄段miRNA表達水平的因素,比較了狹窄段miRNA在年齡、HSCR分型及性別水平上的表達量,結果發(fā)現(xiàn),在1歲以上與1歲以下患兒中,miR-145-3p的相對表達水平無明顯差異(P=0.464), miR-4505的相對表達水平也無明顯差異(P=0.570)；與短段型相比,長段型患兒miR-145-3p的相對表達水平較高,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.034),另外,長段型患兒miR-4505的相對表達水平也高于短段型患兒,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)；在不同性別中,miR-145-3p的相對表達水平無明顯差異(P=0.464),而miR-4505的相對表達水平也無明顯差別(P=0.766)。結論1. miRNA芯片篩選及實時熒光定量PCR驗證結果一致,證實HSCR病變段及擴張段腸管存在miRNAs表達差異,miR-145-3p和miR-4505可能與HSCR的發(fā)病密切相關。2. miR-145-3p和miR-4505的表達量與先天性巨結腸患兒的性別和年齡水平無關,但可能與先天性巨結腸的分型密切相關。探討miR-145-3p和miR-4505的功能及其在HSCR形成過程中的作用將為進一步探討miRNAs在HSCR形成過程中的作用提供新的思路。
【關鍵詞】：先天性巨結腸 微小RNA 基因表達譜 實時定量PCR 靶基因
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R726.5
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-23
• 參考文獻22-23
• 第一章 應用微陣列芯片技術篩選先天性巨結腸組織的miRNA表達譜23-50
• 1.1 資料與方法23-29
• 1.2 實驗結果29-35
• 1.3 討論35-42
• 1.4 小結42-43
• 參考文獻43-50
• 第二章 差異表達miRNAs的靶基因預測50-65
• 1.1 對象與方法50-51
• 1.2 實驗結果51-53
• 1.3 討論53-59
• 1.4 小結59-60
• 參考文獻60-65
• 第三章 應用實時熒光定量PCR技術驗證先天性巨結腸組織中差異表達的miRNAs65-80
• 1.1 資料與方法65-69
• 1.2 實驗結果69-72
• 1.3 討論72-77
• 1.4 小結77-78
• 參考文獻78-80
• 文獻綜述80-92
• 參考文獻87-92
• 攻讀碩士期間發(fā)表論文92-93
• 致謝93-94

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1 ;Impact of tiny miRNAs on cancers[J];World Journal of Gastroenterology;2007年04期

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3 ;放療和miRNAs兩者關系的研究進展(英文)[J];Chinese-German Journal of Clinical Oncology;2012年05期

4 王寧;黃辰;姚嘉宜;艾婷;李圍圍;付學海;宋麗萍;;肺癌相關miRNAs研究進展[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學;2012年05期

5 ;Identification of deregulated miRNAs and their targets in hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2012年38期

6 William CS CHO;南娟;;miRNAs作為癌癥預測和預后標志物的巨大潛能[J];中國肺癌雜志;2013年01期

7 李長貴;紀艷;;miRNAs和內分泌疾病研究進展[J];中華醫(yī)學信息導報;2006年21期

8 William CS CHO;南娟;丁燕;;miRNAs在肺癌中的作用[J];中國肺癌雜志;2009年12期

9 Wen Luo,;Qinghua Nie;Xiquan Zhang;;MicroRNAs Involved in Skeletal Muscle Differentiation[J];遺傳學報;2013年03期

10 ;Small but influential:the role of microRNAs on gene regulatory network and 3′UTR evolution[J];遺傳學報;2009年01期

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1 ;A potential role for Chlamydomonas miRNAs in response to environmental changes[A];中國遺傳學會植物遺傳和基因組學專業(yè)委員會2009年學術研討會論文摘要匯編[C];2009年

2 Ping Xuan;Maozu Guo;Yangchao Huang;;MaturePred:Efficient Identification of MicroRNAs within Novel Plant Pre-miRNAs[A];第五屆全國生物信息學與系統(tǒng)生物學學術大會論文集[C];2012年

3 Zhen-Dong Xiao;Li-Ting Diao;Jian-Hua Yang;Hui Xu;Mian-Bo Huang;Yong-Jin Deng;Hui Zhou;Liang-Hu Qu;;Systematical identification of cis-elements orchestrating the expressions of miRNAs in humans[A];生命的分子機器及其調控網(wǎng)絡——2012年全國生物化學與分子生物學學術大會摘要集[C];2012年

4 ;Cell-free miRNAs may indicate diagnosis and docetaxel sensitivity of tumor cells in malignant effusions[A];2011醫(yī)學科學前沿論壇第十二屆全國腫瘤藥理與化療學術會議論文集[C];2011年

5 任波;馬迪;李毅;;地高辛標記探針結合化學發(fā)光技術快速靈敏檢測植物總RNA中的miRNAs方法[A];中國植物病理學會2005年學術年會暨植物病理學報創(chuàng)刊50周年紀念會論文摘要集[C];2005年

6 任波;馬迪;李毅;;地高辛標記探針結合化學發(fā)光技術快速靈敏檢測植物總RNA中的miRNAs方法[A];中國植物病理學會2005年學術年會暨植物病理學報創(chuàng)刊50周年紀念會論文集[C];2005年

7 戚鵬;韓金祥;魯艷芹;王傳璽;欒中華;卜范峰;;病毒編碼的miRNAs:基因表達新的調控因子[A];山東省藥學會2006年生化與生物技術藥物學術研討會論文集[C];2006年

8 ;Bioinformatic identification and expression analysis of new microRNAs from Medicago truncatula[A];華東六省一市生物化學與分子生物學會2008年學術交流會論文摘要匯編[C];2008年

9 ;Cell-free miRNAs may indicate diagnosis and docetaxel sensitivity of tumor cells in malignant effusions[A];中華醫(yī)學會腫瘤學分會第七屆全國中青年腫瘤學術會議——中華醫(yī)學會腫瘤學分會“中華腫瘤 明日之星”大型評選活動暨中青年委員全國遴選論文匯編[C];2011年

10 ;miRNAs involved in Tau expression of BMSCs induced neurons[A];中國神經(jīng)科學學會第九屆全國學術會議暨第五次會員代表大會論文摘要集[C];2011年

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1 江尚;特異性miRNAs與前列腺癌發(fā)病密切相關[N];中國醫(yī)藥報;2007年

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1 陳健德;新生兒膿毒癥miRNAs表達譜及其免疫調節(jié)作用研究[D];復旦大學;2014年

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9 孟麗雅;惡性轉化BEAS-2B細胞lncRNAs與miRNAs的差異表達[D];鄭州大學;2016年

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本文編號：1057620