本文關鍵詞：表達Flt3L的重組狂犬病病毒的構(gòu)建及其免疫原性的研究

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【摘要】：狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)引起的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染為特征的人畜共患傳染病,人和動物一旦發(fā)病死亡率幾乎達100%(WHO 2009)。全世界每年因狂犬病死亡的人數(shù)超過55000人,我國是狂犬病高發(fā)國家之一。目前狂犬病尚無特效的治療方法或藥物,疫苗的預防接種是該病防控的重要手段。本研究通過反向遺傳操作技術在狂犬病病毒疫苗株LBNSE基因組中插入鼠源FMS樣酪氨酸激酶3配體(Fms-like tyrosine kinase 3 ligand,Flt3L)基因,構(gòu)建了重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L。ELISA檢測結(jié)果表明重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L可在感染的BSR細胞表達Flt3L且具有劑量依賴性。LBNSE-Flt3L在體外生長曲線與親本毒株幾乎一致,表明外源基因Flt3L的表達對病毒的復制與擴散沒有影響。腦部攻毒實驗發(fā)現(xiàn)小鼠并無發(fā)病癥狀,其體重呈先下降后上升的趨勢,較親本毒株LBNSE對小鼠致病性減弱,但差異不顯著。為進一步研究LBNSE-Flt3L的免疫原性,將重組狂犬病病毒免疫小鼠,與親本病毒LBNSE進行比較,并將實驗室之前構(gòu)建的LBNSE-GM-CSF(Wen et al 2011)作為陽性對照。在免疫后第1-10周每周采血檢測其體內(nèi)的中和抗體水平,發(fā)現(xiàn)LBNSE-Flt3L和LBNSE-GM-CSF誘導的抗體水平在第四周均達到最高值,與親本毒株LBNSE相比,LBNSE-Flt3L與LBNSE-GM-CSF相似,均能更快地誘導機體產(chǎn)生更高滴度的抗體。另外,在重組狂犬病病毒免疫后的第二周,對免疫小鼠進行了攻毒實驗,腦內(nèi)注射50LD50的CVS-24病毒,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LBNSE-Flt3L的免疫保護率可達到80%,而LBNSE的免疫保護率則為45%。為進一步研究細胞因子Flt3L增強狂犬病病毒免疫原性的作用機制,我們分離了小鼠骨髓源樹突狀細胞(DC),并感染LBNSE-Flt3L,利用流式細胞儀檢測了重組病毒LBNSE-Flt3L對樹突狀細胞(DC)的激活作用;同時,還將LBNSE-Flt3L感染6周齡小鼠,同樣利用流式細胞術對其感染后DC的激活以及對生發(fā)中心(Germinal Center,GC)的B細胞的的促進情況進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是體外還是體內(nèi)實驗,與Mock組和親本毒株LBNSE相比,LBNSE-Flt3L均可以顯著激活DC,與LBNSE-GM-CSF效果相當,并能促進更多GC B細胞的生成�？傊�,表達Flt3L的重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L可以通過激活DC和促進GC B細胞的生成來增強免疫原性,提高抗病毒中和抗體的水平,從而提高了免疫保護率。本研究將為新型狂犬病疫苗的研究奠定了基礎。
【關鍵詞】：狂犬病 疫苗 Flt3L 中和抗體 樹突狀細胞
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-9
• 縮略語表（Abbreviation）9-11
• 第一章 文獻綜述11-21
• 1.1 狂犬病概述11
• 1.2 狂犬病病原學11-12
• 1.3 狂犬病流行病學12-13
• 1.3.1 傳染源12
• 1.3.2 傳播途徑12-13
• 1.3.3 易感動物13
• 1.3.4 流行情況13
• 1.4 狂犬病臨床診斷學13-14
• 1.4.1 臨床癥狀13-14
• 1.4.2 診斷14
• 1.5 狂犬病防控現(xiàn)狀14-15
• 1.5.1 國外防控現(xiàn)狀14-15
• 1.5.2 國內(nèi)防控現(xiàn)狀15
• 1.6 狂犬病病毒致病機制15-16
• 1.6.1 狂犬病病毒受體15
• 1.6.2 狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白對其致病性的影響15-16
• 1.7 狂犬病疫苗研究進展16-18
• 1.7.1 常規(guī)疫苗16-17
• 1.7.2 新型疫苗17-18
• 1.8 Flt3L研究進展18-21
• 1.8.1 Flt3L的結(jié)構(gòu)與特性18
• 1.8.2 Flt3L的生物學活性18-21
• 第二章 研究目的及意義21-22
• 第三章 材料與方法22-36
• 3.1 材料22-24
• 3.1.1 細胞、病毒、細菌及載體22
• 3.1.2 主要藥品及試劑22-23
• 3.1.3 主要相關試劑配制23
• 3.1.4 主要儀器與設備23-24
• 3.1.5 實驗動物24
• 3.2 方法24-36
• 3.2.1 人源與鼠源Flt3L同源性的比較24
• 3.2.2 鼠源Flt3L基因的獲取24-26
• 3.2.3 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L感染性克隆的構(gòu)建26-29
• 3.2.4 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的拯救29
• 3.2.5 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的鑒定29-30
• 3.2.6 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的擴增30
• 3.2.7 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的滴定30
• 3.2.8 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的生長曲線30
• 3.2.9 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的致病性實驗30-31
• 3.2.10 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的免疫性及保護率實驗31-32
• 3.2.11 小鼠樹突狀細胞（DC）的體外分離與培養(yǎng)32-33
• 3.2.12 流式細胞術33-36
• 第四章 結(jié)果與分析36-50
• 4.1 人源與鼠源Flt3L同源性的比較36-37
• 4.2 鼠源Flt3L基因的獲取37-38
• 4.3 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L感染性克隆的構(gòu)建38-39
• 4.4 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的鑒定39-40
• 4.4.1 免疫熒光檢測39
• 4.4.2 Flt3L的表達檢測39-40
• 4.5 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的生長曲線40-41
• 4.6 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的致病性實驗41
• 4.7 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的免疫性及保護率實驗41-43
• 4.7.1 重組病毒免疫小鼠后中和抗體的測定41-42
• 4.7.2 重組病毒免疫小鼠后保護率實驗42-43
• 4.8 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L對DC的體外激活43-45
• 4.9 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L對DC的體內(nèi)激活45-48
• 4.10 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L對GC B的影響48-50
• 第五章 討論50-53
• 第六章 結(jié)論53-54
• 參考文獻54-61
• 致謝61

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本文編號：985913