本文關(guān)鍵詞：下調(diào)TRIM28對(duì)牛早期胚胎印記甲基化維持的影響研究

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【摘要】：基因組印記源于雙親基因組差異表觀修飾,通過(guò)這種差異表觀修飾機(jī)制,使父源或母源等位基因出現(xiàn)特異的單等位基因表達(dá)。在哺乳動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中,有兩個(gè)重要的全基因組表觀遺傳重編程時(shí)期,分別是生殖細(xì)胞發(fā)育時(shí)期和受精后到早期胚胎發(fā)育時(shí)期。在此期間基因組印記甲基化經(jīng)歷一個(gè)去除、重建和維持的復(fù)雜過(guò)程。這個(gè)過(guò)程中的任何環(huán)節(jié)被干擾都將導(dǎo)致印記紊亂,造成胚胎發(fā)生、胎盤形成及出生后發(fā)育異常。因此,在早期胚胎全基因組重編程過(guò)程中,對(duì)印記的識(shí)別和維持十分重要。母源效應(yīng)蛋白TRIM28在此過(guò)程中起重要的調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)以牛為研究對(duì)象,通過(guò)亞硫酸鹽測(cè)序、RNAi和熒光定量PCR等分子生物學(xué)和胚胎工程技術(shù),分析精子、成熟卵母細(xì)胞(MⅡ)、植入前不同發(fā)育階段IVF胚胎(2細(xì)胞、4細(xì)胞、8細(xì)胞、囊胚)及不同發(fā)育階段TRIM28下調(diào)IVF胚胎相應(yīng)的印記基因DMRs甲基化狀態(tài),探討TRIM28在植入前胚胎印記基因甲基化維持中的作用,主要得出以下結(jié)果:1.運(yùn)用免疫組化法和RT-PCR法對(duì)成熟卵母細(xì)胞(MⅡ)及顆粒細(xì)胞進(jìn)行TRIM28的檢測(cè),證明卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞中均有TRIM28的表達(dá),其主要分布在卵母細(xì)胞細(xì)胞核及卵泡顆粒細(xì)胞核內(nèi)。2.由上海吉瑪公司化學(xué)合成3條針對(duì)TRIM28的siRNA(分別為1、6和7),以及1對(duì)無(wú)義siRNA(+),通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法對(duì)si RNA干擾效果進(jìn)行篩選,結(jié)果表明使用1、6、7三種siRNA的混合物(si M)對(duì)TRIM28進(jìn)行下調(diào)干擾的效果最好,下調(diào)結(jié)果達(dá)到84.47%,表明RNAi技術(shù)是基因功能研究的有效途徑。3.RNAi干擾對(duì)卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育卵裂狀況的影響:正常的卵母細(xì)胞成熟時(shí)間為18-22 h,成熟率為80.38±3.92%,TRIM28下調(diào)的卵母細(xì)胞的成熟時(shí)間為23-24 h,成熟率為75.44±2.30%,二者成熟率差異不顯著。正常IVF胚胎開(kāi)始卵裂時(shí)間為受精后16-22h,卵裂率為63.84±2.22%,TRIM28下調(diào)的IVF胚胎開(kāi)始卵裂時(shí)間為受精后28-32 h,卵裂率為49.28±2.73%,二者差異顯著。4.TRIM28下調(diào)對(duì)胚胎不同發(fā)育階段印記基因DMRs甲基化程度的影響:正常IVF胚胎不同發(fā)育階段(2細(xì)胞、4細(xì)胞、8細(xì)胞、囊胚)父系印記基因H19的DMRs甲基化程度分別為74.0%、68.40%、68.30%和84.20%,母系印記基因Mest的DMRs甲基化程度分別為88.1%、81.90%、78.50%和75.60%,Peg10的DMRs甲基化程度分別為88.5%、76.20%、85.00%和82.10%。卵母細(xì)胞TRIM28下調(diào)的IVF胚胎不同發(fā)育階段(2細(xì)胞、4細(xì)胞、8細(xì)胞)父系印記基因H19的DMRs甲基化程度分別為1.9%、22.50%和39.70%,母系印記基因Mest的DMRs甲基化程度分別為89.6%、29.50%和54.50%,Peg10的DMRs甲基化程度分別為81.0%、67.10%和70.80%。綜上,TRIM28在成熟卵母細(xì)胞(MⅡ)及顆粒細(xì)胞中均有表達(dá),TRIM28下調(diào)對(duì)卵母細(xì)胞成熟影響較小,但對(duì)胚胎發(fā)育有顯著影響;母源TRIM28下調(diào)對(duì)父系印記基因H19的DMRs甲基化程度的影響最為顯著,2細(xì)胞H19 DMR甲基化幾乎完全丟失,4細(xì)胞、8細(xì)胞階段雖有一定程度上升,但仍顯著低于IVF胚胎。但下調(diào)TRIM28對(duì)母系印記基因Mest和Peg10的DMRs甲基化程度的影響不顯著。
【關(guān)鍵詞】：印記基因 TRIM28 牛植入前胚胎 RNAi
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S823
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-10
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述10-15
• 1.1 印記基因10-12
• 1.2 轉(zhuǎn)錄共抑制因子TRIM2812-13
• 1.3 印記基因H19、Mest及Peg10的結(jié)構(gòu)與功能13-15
• 第二篇 研究?jī)?nèi)容15-44
• 第一章 卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞中TRIM28的檢測(cè)15-23
• 1.1 材料15-16
• 1.2 研究方法16-19
• 1.3 結(jié)果與分析19-21
• 1.4 討論21-22
• 1.5 小結(jié)22-23
• 第二章 下調(diào)TRIM28 siRNA的篩選23-31
• 2.1 材料23
• 2.2 研究方法23-28
• 2.3 結(jié)果與分析28-30
• 2.4 討論30
• 2.5 小結(jié)30-31
• 第三章 TRIM28下調(diào)對(duì)胚胎發(fā)育及基因組印記的影響31-44
• 3.1 材料31
• 3.2 研究方法31-35
• 3.3 結(jié)果與分析35-40
• 3.4 討論40-42
• 3.5 小結(jié)42-44
• 結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-51
• 作者簡(jiǎn)介51-52
• 致謝52

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