本文關(guān)鍵詞：牛干擾素誘導(dǎo)蛋白10的原核表達(dá)及其單克隆抗體的研制

  更多相關(guān)文章： 牛干擾素誘導(dǎo)蛋白10 原核表達(dá) ELISA 單克隆抗體

【摘要】：干擾素誘導(dǎo)蛋白10 (interferon-inducible protein-10, IP-10)是抗原提呈細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞因子刺激后分泌的趨化因子,屬于CXC趨化因子家族。IP-10在感染性疾病、自身免疫性疾病、同種異體移植排斥反應(yīng)、腫瘤、慢性炎癥等疾病中可選擇性地募集T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和單核細(xì)胞到損傷部位,發(fā)揮重要的宿主免疫防護(hù)作用。最近的研究顯示IP-10表達(dá)水平的改變與感染性疾病,包括炎癥性疾病、免疫功能異常與腫瘤的發(fā)展等相關(guān)。IP-10也開始在牛結(jié)核等感染性疾病的診斷中作為重要的生物標(biāo)志物,其效果也常與γ-干擾素釋放試驗(yàn)(interferon gamma release assay, IGRA)相比較。有研究表明聯(lián)合檢測(cè)IFN-γ和IP-10能提高牛結(jié)核診斷的敏感性。本研究克隆表達(dá)了牛IP-10基因并制備了牛IP-10單克隆抗體,為牛結(jié)核的預(yù)防與診斷研究提供了重要的生物材料。1.牛IP-10基因的克隆及原核表達(dá)用ConA刺激健康奶牛外周血淋巴細(xì)胞,并提取細(xì)胞總RNA,以RT-PCR方法反轉(zhuǎn)錄為cDNA,再以cDNA為模板成功擴(kuò)增到所需目的基因。將目的基因分別與表達(dá)載體pGEX-6p-1和pET-30a(+)相連接構(gòu)建重組質(zhì)粒,并進(jìn)行鑒定。鑒定正確后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3),分別構(gòu)建了BL21 (DE3)-pGEX-6p-1-BoIP-10和BL21(DE3)-pET-30a-BoIP-10。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的SDS-PAGE分析,出現(xiàn)預(yù)期的目的條帶,條帶大小分別為36 kDa和16 kDa左右。通過GST和His免疫親和層析法進(jìn)行蛋白的純化,Western blot結(jié)果顯示純化蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性,說明2種標(biāo)簽的重組蛋白rGST-BoIP-10和rHis-BoIP-10均獲得成功表達(dá)。2.牛IP-10單克隆抗體的制備與鑒定將純化重組蛋白rHis-BoIP-10免疫6周齡BALB/c小鼠,經(jīng)3次免疫后,運(yùn)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)融合細(xì)胞,以純化重組蛋白rGST-BoIP-10為檢測(cè)原,運(yùn)用間接ELISA方法篩選陽性克隆,經(jīng)過2次亞克隆后,共獲得8株能穩(wěn)定分泌特異性BoIP-10單抗的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為3E11、2A5、1C6、3B12、3E12、2D5、2H8、3A12。亞型鑒定結(jié)果顯示2A5和3E12單抗為IgM亞型,3E11和2D5為IgG2a亞型,2H8的為IgG3亞型,1C6、3B12、3A12為IgG1亞型。間接ELISA測(cè)定效價(jià)結(jié)果顯示3E11、2A5、3B12、 3E12、2H8五株單抗上清效價(jià)均不超過6400,其余3株1C6、2D5、3A12上清效價(jià)比較高,在1.0×104以上；制備上述單抗腹水,間接ELISA測(cè)定其效價(jià),除了2A5的腹水效價(jià)比較低,其余7株單抗的腹水效價(jià)均在1.0×106以上。間接ELISA還顯示3E11、2A5、 2D5、2H8四株單抗與大腸桿菌表達(dá)的商品化牛IP-10有較好的反應(yīng)性,2A5、2D5、2H8等3株單抗與畢赤酵母表達(dá)的商品化牛IP-10有較好的反應(yīng)性。Western blot結(jié)果顯示所獲得的8株單抗均與融合蛋白rHis-BoIP-10和rGST-BoIP-10發(fā)生反應(yīng)。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)染色技術(shù)分析單抗與天然IP-10蛋白的反應(yīng)性,結(jié)果顯示3E11,2D5和3A12與天然BoIP-10有較好的反應(yīng)性。阻斷ELISA結(jié)果也表明2D5與天然BoIP-10有較好的反應(yīng)性。這些結(jié)果表明2D5單抗與天然牛IP-10反應(yīng)性良好,具有較好的應(yīng)用潛能。
【關(guān)鍵詞】：牛干擾素誘導(dǎo)蛋白10 原核表達(dá) ELISA 單克隆抗體
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S823
【目錄】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-7
• 符號(hào)說明7-9
• 文獻(xiàn)綜述 IP-10的生物學(xué)特性及其在感染性疾病中的診斷價(jià)值9-21
• 1 IP-10生物學(xué)特性9-11
• 2 IP-10與疾病的關(guān)系11-13
• 3 IP-10對(duì)于感染性疾病的診斷價(jià)值13-15
• 參考文獻(xiàn)15-21
• 第一章 牛IP-10基因的克隆及原核表達(dá)21-33
• 1. 材料與試劑21-22
• 2 方法22-27
• 3 結(jié)果27-31
• 4 討論31
• 參考文獻(xiàn)31-33
• 第二章 牛IP-10單克隆抗體的制備與鑒定33-48
• 1 材料與試劑33-34
• 2 方法34-40
• 3 結(jié)果40-46
• 4 討論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-48
• 致謝48-49

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：978192