本文關(guān)鍵詞：LH誘導(dǎo)山羊卵泡膜細(xì)胞Akt磷酸化及對雄激素生成的影響

  更多相關(guān)文章： 卵泡膜細(xì)胞 LH PI3K/Akt信號通路 雄激素 山羊

【摘要】：卵泡膜細(xì)胞的一個(gè)重要功能是合成雄激素,而雄激素再通過顆粒細(xì)胞合成雌激素。卵泡膜細(xì)胞通過為顆粒細(xì)胞提供雄激素的方式在調(diào)控卵巢類固醇激素生成方面發(fā)揮重要的作用。卵巢功能的正常運(yùn)轉(zhuǎn)有賴于卵泡膜細(xì)胞生成類固醇激素活動的精確調(diào)節(jié),而這種調(diào)節(jié)對于卵泡發(fā)育至關(guān)重要。卵泡膜細(xì)胞雄激素的生成主要由垂體釋放的LH調(diào)控,垂體產(chǎn)生的LH隨血液轉(zhuǎn)運(yùn)至卵泡膜細(xì)胞而發(fā)揮調(diào)控作用。已證實(shí)PI3K/Akt信號通路在多種細(xì)胞生命活動過程中發(fā)揮重要的作用,例如細(xì)胞的新陳代謝、細(xì)胞存活、炎癥的發(fā)生、細(xì)胞生長、細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成等。研究LH在誘導(dǎo)卵泡膜細(xì)胞雄激素生成過程中細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用,對揭示卵巢生理功能及由于卵泡膜細(xì)胞生成類固醇過度引起的卵巢機(jī)能異常有重要意義。本研究利用體外培養(yǎng)的山羊卵泡膜細(xì)胞,研究了LH對PI3K/Akt信號通路的作用及對雄激素的生成的影響。主要研究結(jié)果如下:(1)通過機(jī)械分離結(jié)合膠原酶消化法和差速貼壁法,分離、純化獲得卵泡膜細(xì)胞。體外培養(yǎng)觀察,卵泡膜細(xì)胞呈成纖維樣,貼壁生長。傳代至8代后,開始發(fā)生老化,生長變慢。細(xì)胞免疫熒光觀察計(jì)數(shù),分離得到的卵泡膜細(xì)胞波形蛋白染色呈陽性,陽性率為98.56±0.53%,角蛋白染色呈陰性,說明所獲得的卵泡膜細(xì)胞可用于后續(xù)試驗(yàn)。(2)將卵泡膜細(xì)胞與LH共孵育,通過蛋白免疫印跡法分別檢測細(xì)胞內(nèi)總Akt及其磷酸化水平,發(fā)現(xiàn)卵泡膜細(xì)胞的Akt磷酸化水平在LH處理后12h達(dá)到峰值。而卵泡膜細(xì)胞與LH和PI3K抑制劑共同孵育后,發(fā)現(xiàn)PI3K抑制劑能抑制LH誘導(dǎo)的Akt磷酸化。表明LH可以激活卵泡膜細(xì)胞的Akt信號通路。(3)通過qRT-PCR檢測結(jié)果表明LH誘導(dǎo)山羊卵泡膜細(xì)胞CYP11A1和CYP17A1基因表達(dá)顯著升高(P0.05);添加PI3K的抑制劑LY294002后,顯著降低LH誘導(dǎo)的CYP11A1、CYP17A1和StAR基因的表達(dá)(P0.05),但對LH誘導(dǎo)HSD3B1基因表達(dá)差異不顯著(P0.05);添加PI3K抑制劑wormannin后顯著降低LH誘導(dǎo)的CYP17A1和CYP11A1基因的表達(dá)(P0.05),而對LH誘導(dǎo)的StAR和HSD3B1基因表達(dá)影響差異不顯著(P0.05);LH顯著促進(jìn)LHR基因的表達(dá),添加LY294002后顯著降低LHR基因的表達(dá)(P0.05),而wormannin抑制作用不顯著(P0.05);LH顯著提高卵泡膜雄激素的分泌(P0.05),而添加wormannin和LY294002后顯著降低LH誘導(dǎo)的雄激素分泌(P0.05)。表明PI3K/Akt信號通路參與卵泡膜細(xì)胞分泌雄激素的過程。綜上所述,本試驗(yàn)分離純化了山羊卵泡膜細(xì)胞,利用體外培養(yǎng)的方式研究了LH通過PI3K/Akt信號通路介導(dǎo)卵泡膜細(xì)胞雄激素的生成過程。為進(jìn)一步研究卵泡膜細(xì)胞雄激素生成的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制以及卵泡膜細(xì)胞對卵泡發(fā)育的作用奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：卵泡膜細(xì)胞 LH PI3K/Akt信號通路 雄激素 山羊
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S827
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-24
• 1.1 卵巢卵泡膜細(xì)胞及其功能的研究進(jìn)展12-19
• 1.1.1 什么是卵泡膜細(xì)胞12-13
• 1.1.2 卵泡膜細(xì)胞的來源與結(jié)構(gòu)13
• 1.1.3 卵泡膜細(xì)胞的功能13-15
• 1.1.4 卵泡膜細(xì)胞的壽命15
• 1.1.5 影響卵泡膜細(xì)胞分化的主要因子15-19
• 1.2 PI3K/Akt信號通路的研究進(jìn)展19-23
• 1.2.1 PI3K19-20
• 1.2.2 PI3K的激活機(jī)制20-21
• 1.2.3 PKB/Akt21
• 1.2.4 Akt的激活機(jī)制21-22
• 1.2.5 Akt調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物過程22-23
• 1.2.6 PI3K/Akt信號通路抑制劑23
• 1.3 本研究的目的意義23-24
• 第二章 山羊卵泡膜細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定24-29
• 2.1 材料與試劑24
• 2.1.1 材料24
• 2.1.2 主要儀器與設(shè)備24
• 2.1.3 主要試劑及配制方法24
• 2.2 試驗(yàn)方法24-26
• 2.2.1 卵泡膜細(xì)胞的分離純化24-25
• 2.2.2 卵泡膜細(xì)胞的培養(yǎng)25
• 2.2.3 卵泡膜細(xì)胞的鑒定25-26
• 2.3 試驗(yàn)結(jié)果26-27
• 2.3.1 卵泡膜細(xì)胞的形態(tài)特征26
• 2.3.2 卵泡膜細(xì)胞鑒定結(jié)果26-27
• 2.4 討論27-28
• 2.5 本章小結(jié)28-29
• 第三章 LH對卵泡膜細(xì)胞PI3K/Akt信號通路的作用29-35
• 3.1 材料和試劑29-30
• 3.1.1 材料29
• 3.1.2 主要試劑及配制方法29-30
• 3.1.3 主要儀器和設(shè)備30
• 3.2 試驗(yàn)方法30-31
• 3.2.1 LH處理卵泡膜細(xì)胞30
• 3.2.2 PI3K抑制劑處理卵泡膜細(xì)胞30
• 3.2.3 細(xì)胞總蛋白的提取及蛋白免疫印跡（Western blot analysis）30-31
• 3.3 試驗(yàn)結(jié)果31-33
• 3.3.1 LH處理后蛋白免疫印跡結(jié)果31-32
• 3.3.2 PI3K抑制劑處理卵泡膜細(xì)胞的蛋白印跡結(jié)果32-33
• 3.4 討論33-34
• 3.5 小結(jié)34-35
• 第四章 PI3K抑制劑對卵泡膜細(xì)胞雄激素生成的影響35-42
• 4.1 材料和試劑35-36
• 4.1.1 材料35
• 4.1.2 主要試劑及配制方法35-36
• 4.1.3 主要儀器和設(shè)備36
• 4.2 試驗(yàn)方法36-38
• 4.2.1 LH和抑制劑處理卵泡膜細(xì)胞36
• 4.2.2 cDNA的制備和實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)36-37
• 4.2.3 雄激素的測定37
• 4.2.4 統(tǒng)計(jì)分析37-38
• 4.3 試驗(yàn)結(jié)果38-40
• 4.3.1 類固醇合成酶基因的表達(dá)38-39
• 4.3.2 LH反應(yīng)性39
• 4.3.3 雄激素的濃度39-40
• 4.4 討論40-41
• 4.5 小結(jié)41-42
• 全文結(jié)論42-43
• 創(chuàng)新點(diǎn)和后續(xù)研究的主要課題43-44
• 創(chuàng)新點(diǎn)43
• 后續(xù)研究的主要問題43-44
• 參考文獻(xiàn)44-52
• 縮略 詞52-53
• 致謝53-54
• 作者簡介54

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本文編號：970870