本文關鍵詞：豬Rac1基因表達規(guī)律及真核表達載體的構建

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【摘要】：肌肉中肌纖維的數(shù)量在出生時期就已經(jīng)固定,出生后數(shù)量不再發(fā)生變化。肌肉的發(fā)育不僅僅在于肌細胞的增殖,更與肌細胞的融合相關Ras相關的C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, Rac1)是Rho GTP酶家族里Rac亞家族中的一員,可調(diào)控細胞極性、吞噬作用、細胞遷移、囊泡的轉(zhuǎn)運以及調(diào)節(jié)肌動蛋白骨架的形成等。該基因與成肌細胞的融合密切相關,在肌纖維增粗和肌肉產(chǎn)量增多的過程中發(fā)揮重要作用。采用qRT-PCR和Western blot技術檢測Racl基因在出生1日齡的馬身豬的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎、胰臟、舌、小腸、下丘腦、胃、背最長肌等組織的mRNA和蛋白表達譜,以及Racl基因在馬身豬和大白豬從1日齡到180日齡背最長肌中的表達,了解Racl基因的表達規(guī)律;成功構建了pAcGFP-Rac1真核表達載體,為研究Racl的功能奠定基礎。主要結果如下：(1)Racl基因mRNA在出生1日齡馬身豬的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎、胰臟、舌、小腸、胃和背最長肌組織中均有表達,其中,Racl基因mRNA在肺組織中的表達量最高,極顯著高于其他組織(P0.01),下丘腦中表達量較高,顯著高于其他組織的表達情況(P0.05),肝臟組織中Racl的表達量最低。Racl蛋白在出生1日齡的馬身豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎、脊髓、小腦、下丘腦、胃、背最長肌、腰大肌、股二頭肌以及背部脂肪中表達,其中脊髓、下丘腦和背脂中表達量最高,與其他組織差異極顯著(P0.01),脾臟、肺和腎臟表達量較高,小腦、胃部表達量較低且胃部表達量最低。(2)Racl基因mRNA在大白豬和馬身豬背最長肌中的發(fā)育性表達模式中發(fā)現(xiàn),大白豬1日齡、120日齡和180日齡時表達量最高,與其他日齡相比差異極顯著(P0.01)。其他日齡表達量均維持在較低水平,且60日齡時表達量最低。馬身豬60日齡時表達量最高,與其他日齡相比差異極顯著(P0.01),90日齡時表達量顯著下降,隨后Racl基因的表達量呈下降趨勢且維持在較低的表達水平,150日齡時表達量最低。同一發(fā)育階段兩品種間進行比較,mRNA水平上,除了30日齡外,其他幾個日齡的表達量差異極顯著(P0.01),但沒有明顯規(guī)律；蛋白水平上,大白豬在1日齡表達量最高,120日齡表達量最低,從30日齡至120日齡表達量成呈下降趨勢,后又呈上升趨勢;馬身豬各日齡表達量均處于較高的水平,其中60日齡表達量最高,顯著高于其他幾個日齡(P0.01),90日齡時表達量最低。兩豬種間比較發(fā)現(xiàn),馬身豬Racl蛋白每個階段的表達量都高于大白豬,其中1日齡和60日齡的表達量差異極顯著(P0.01)。(3)Racl基因克隆片段與pAcGFP-N1載體連接,通過PCR反應、單酶切和雙酶切鑒定以及測序結果表明,pAcGFP-Rac1真核表達載體構建成功。
【關鍵詞】：豬 Rac1基因 表達譜 發(fā)育性表達 pAcGFP-N1構建
【學位授予單位】：山西農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S828
【目錄】：

• 摘要7-9
• 前言9-10
• 第一章 文獻綜述10-18
• 1 動物肌肉發(fā)育的研究10
• 1.1 動物肌肉發(fā)育的基本過程10
• 2 成肌細胞融合過程10-12
• 2.1 遷移10-11
• 2.2 識別和粘附11
• 2.3 粘附位點或者融合位點肌動蛋白的調(diào)控11-12
• 2.4 融合位點的囊泡的轉(zhuǎn)運12
• 3 Rac1基因的研究進展12-17
• 3.1 Rac1基因簡介12-13
• 3.2 Rac1基因和蛋白13
• 3.3 Rac1的作用機制13-14
• 3.4 Rac1的生物學功能14-17
• 4 展望17-18
• 第二章 馬身豬不同組織Rac1基因mRNA和蛋白質(zhì)表達譜18-32
• 1 材料與方法18-26
• 1.1 試驗樣品18
• 1.2 主要儀器18-19
• 1.3 主要試劑及配方19-21
• 1.4 試驗方法21-26
• 2 結果與分析26-30
• 2.1 RNA的檢測26
• 2.2 標準曲線的建立26-27
• 2.3 擴增動力學曲線27-28
• 2.4 擴增熔解曲線28
• 2.5 馬身豬Rac1基因表達譜28-29
• 2.6 馬身豬Rac1蛋白表達譜29-30
• 3 討論30-32
• 第三章 馬身豬和大白豬背最長肌中Rac1基因mRNA和蛋白的發(fā)育性表達32-37
• 1 材料與方法32
• 1.1 試驗動物及材料32
• 1.2 試驗儀器及試劑32
• 1.3 試驗方法同第二章32
• 2 結果與分析同第二章32-35
• 2.1 大白豬和馬身豬背最長肌Rac1 mRNA的發(fā)育性表達32-34
• 2.2 大白豬和馬身豬背最長肌Rac1蛋白的發(fā)育性表達34-35
• 3 討論35-37
• 第四章 Rac1基因融合蛋白真核表達載體pAcGFP-Rac1的構建37-56
• 1 材料與方法37-46
• 1.1 動物材料和質(zhì)粒載體37-38
• 1.2 試驗方法38-39
• 1.3 Rac1基因PCR擴增39-40
• 1.4 PCR產(chǎn)物的純化與克隆40-41
• 1.5 Rac1基因克隆產(chǎn)物鑒定41-43
• 1.6 Rac1基因真核表達載體的構建43-46
• 2 pAcGFP-Rac1真核表達載體的鑒定46-47
• 2.1 pAcGFP-Rac1真核表達載體的PCR鑒定46
• 2.2 pAcGFP-N1-Rac1雙酶切鑒定46-47
• 3 結果47-51
• 3.1 小鼠肌肉總RNA純度及完整性鑒定47-48
• 3.2 小鼠肌肉組織Rac1基因PCR擴增結果48
• 3.3 Rac1基因的克隆測序48-51
• 4 pAcGFP-Rac1真核表達載體的構建51-55
• 4.1 帶酶切位點的Rac1序列擴增51-52
• 4.2 Rac1基因片段和pAcGFP-N1載體雙酶切52
• 4.3 pAcGFP-Rac1真核表達載體的驗證52-54
• 4.4 pAcGFP-Rac1載體測序結果54-55
• 5 討論55-56
• 全文結論56-57
• 參考文獻57-61
• Abstract61-63
• 致謝63

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本文編號：970662