本文關鍵詞：豬腺病毒3型PCR檢測方法的建立及Hexon基因克隆分析

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【摘要】：豬腺病毒3型(Porcine adeno virus 3, PADV-3)是豬腺病毒中最常見的一種血清型,主要引起豬群腹瀉。1964年Haig首次從英格蘭腹瀉仔豬直腸拭子中分離到該病毒,隨后在澳大利亞、美國、加拿大、西班牙、中國等國家相繼被報道。目前,由于對PADV-3研究較少,在該病毒結構和功能、診斷方法、流行病學、致病性等方面均有待深入系統(tǒng)研究。本研究根據GeenBank中登陸的PADV-3 E1B基因序列(登錄號：AB026117),利用Primer 5.0軟件設計兩對特異性引物,預計擴增片段大小分別為247 bp和194 bp。經條件優(yōu)化,成功建立了針對PADV-3 PCR檢測方法和熒光定量PCR檢測方法,兩種方法的特異性和重復性較好,且均具有較高靈敏度,分別最低可檢3.7×10~5拷貝/μL和3.1×10~2拷貝/μL。應用本研究建立的常規(guī)PCR開展PADV-3感染情況調查,對從四川省部分地區(qū)收集的283份糞便樣品進行檢測。結果顯示,PADV-3總陽性率為7.07%(20/283),非腹瀉豬群PADV-3陽性率為3.31%,腹瀉豬群中PADV-3陽性率為9.87%,顯著高于非腹瀉豬群。應用所建實時熒光定量PCR開展PADV-3感染組織特性研究,對8頭PADV-3感染陽性仔豬相應組織器官進行采樣檢測。結果顯示,腸粘膜、腸系膜淋巴結、肺、扁桃體中PADV-3含量分別為2.24×10~4～6.42×10~5拷貝/mg、9.49×10~3-7.36×10~4拷貝/mg、5.59×10~3～1.65×10~5拷貝/mg和9.93×10~3～1.89×10~5拷貝/mg,病毒含量顯著高于其它組織器官。根據GenBank中PADV-3 Hexon基因序列(登錄號：AC 000189)設計兩對引物。以陽性病料DNA為模板,分段擴增克隆,經測序分析,得到Hexon全基因序列(登錄號：KU761583)。利用生物信息學軟件對所獲PADV-3 Hexon全基因進行分析。結果顯示,所獲Hexon全基因為2799 bp,編碼932個氨基酸,理論分子質量為10~5653.8 u,理論等電點為5.23；該蛋白不穩(wěn)定指數為42.92,屬不穩(wěn)定蛋白；且同一氨基酸的不同密碼子的選擇上存在一定的偏向性。該蛋白最大疏水指數和最小疏水指數分別為2.289和-3.011,表現一定疏水性；氨基酸中無信號肽切割位點,推測該蛋白缺乏信號肽。Hexon蛋白含有25個絲氨酸、18個蘇氨酸、21個絡氨酸激酶磷酸化位點和35個抗原位點。將PADV-3克隆株(SCMS01株)與參考株的Hexon基因核昔酸序列進行同源性分析。結果顯示,核苷酸同源性為87.8%-10~0%,表明PADV-3在各國之間流行不穩(wěn)定。對SCMSOl株和參考株Hexon基因構建系統(tǒng)進化樹。結果顯示,SCMSOl株與德國株(PGOU244)在一個小分支上,兩者親緣性較高。
【關鍵詞】：豬腺病毒3型 PCR Hexon基因 生物信息學分析
【學位授予單位】：四川農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.651
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 常用縮略詞表8-13
• 文獻綜述13-21
• 1 病原學13-18
• 1.1 腺病毒的分類13-14
• 1.2 PADV-3基因組結構及特點14-15
• 1.3 PADV-3 Hexon和E區(qū)基因的結構功能15-16
• 1.4 PADV-3生物學特性16
• 1.5 PADV-3病原流行16-17
• 1.6 疫苗載體應用17-18
• 2 檢測方法研究應用18-20
• 2.1 免疫電子顯微鏡18-19
• 2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗19
• 2.3 聚合酶鏈式反應19-20
• 3 前景展望20
• 4 研究的目的與意義20-21
• 第一章 豬腺病毒3型PCR檢測方法的建立21-42
• 1 試驗材料21-23
• 1.1 陽性病料21
• 1.2 臨床樣品的收集21-22
• 1.3 主要試劑22
• 1.4 主要儀器22
• 1.5 溶液配制22-23
• 2 試驗方法23-30
• 2.1 PADV-3 PCR檢測方法的建立23-28
• 2.1.1 引物合成與設計23
• 2.1.2 病毒DNA提取23-24
• 2.1.3 目的片段PCR擴增24
• 2.1.4 PCR產物的回收及純化24-25
• 2.1.5 感受態(tài)細胞的制備25-26
• 2.1.6 連接轉化26
• 2.1.7 質粒的提取與鑒定26-27
• 2.1.8 反應條件的優(yōu)化27
• 2.1.9 特異性試驗27
• 2.1.10 敏感性試驗27
• 2.1.11 重復性試驗27
• 2.1.12 PADV-3感染情況調查27-28
• 2.2 PADV-3實時熒光定量PCR檢測方法的建立28-30
• 2.2.1 熒光定量PCR引物的設計28
• 2.2.2 病毒核酸的提取28
• 2.2.3 陽性標準品的制備28-29
• 2.2.4 反應條件的優(yōu)化29
• 2.2.5 標準曲線的建立29
• 2.2.6 特異性試驗29
• 2.2.7 實時熒光定量PCR和常規(guī)PCR敏感度29
• 2.2.8 重復性及再現性評估29-30
• 2.2.9 PADV-3感染組織特性研究30
• 3 結果30-39
• 3.1 PADV-3 PCR檢測方法建立結果30-34
• 3.1.1 退火溫度和引物濃度優(yōu)化結果30-31
• 3.1.2 目的片段克隆與序列分析31
• 3.1.3 PCR的特異性試驗結果31-32
• 3.1.4 PCR敏感性試驗結果32
• 3.1.5 PCR重復性試驗結果32-33
• 3.1.6 PADV-3感染情況調查33-34
• 3.2 PADV-3實時熒光定量PCR建立結果34-39
• 3.2.1 優(yōu)化實時熒光定量PCR檢測條件34
• 3.2.2 實時熒光定量PCR標準曲線的繪制34-35
• 3.2.3 熔解曲線和特異性分析35-36
• 3.2.4 PADV-3實時熒光定量PCR敏感性36-37
• 3.2.5 重復性及再現性評估37-38
• 3.2.6 PADV-3感染組織特性研究38-39
• 4 討論39-41
• 4.1 PCR的檢測方法39-40
• 4.2 實時熒光定量PCR的檢測方法40-41
• 5 小結41-42
• 第二章 HEXON基因克隆分析42-52
• 1 試驗材料42
• 1.1 生物信息學軟件42
• 2 試驗方法42-44
• 2.1 引物的設計與合成42
• 2.2 PADV-3 Hexon全基因克隆與測序42-43
• 2.3 Hexon蛋白基本理化性質分析43
• 2.4 Hexon基因密碼子的偏嗜性分析43
• 2.5 抗原表位預測分析43
• 2.6 Hexon蛋白疏水性分析43
• 2.7 Hexon蛋白信號肽分析43
• 2.8 Hexon蛋白磷酸化位點分析43
• 2.9 遺傳變異分析43-44
• 3 結果44-49
• 3.1 Hexon基因克隆與鑒定44-45
• 3.2 Hexon蛋白基本理化性質分析45
• 3.3 Hexon基因密碼子的偏嗜性分析45
• 3.4 抗原表位預測分析45-46
• 3.5 Hexon蛋白疏水性分析46-47
• 3.6 Hexon蛋白信號肽分析47-48
• 3.7 Hexon蛋白磷酸化位點分析48
• 3.8 遺傳變異分析48-49
• 4 討論49-51
• 5 小結51-52
• 全文結論52-53
• 參考文獻53-57
• 致謝57-58
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文58

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本文編號：968605