本文關(guān)鍵詞：豬鼻支原體表面可變蛋白家族介導(dǎo)黏附宿主細(xì)胞能力研究

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【摘要】：豬鼻支原體(Mycoplasma hyorhinis)可引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎及中耳炎等多種慢性炎癥,感染率極高,且與人類腫瘤的發(fā)生有關(guān),對人類健康構(gòu)成威脅。已有研究表明豬鼻支原體表面可變脂蛋白(vlp)家族參與了黏附宿主細(xì)胞過程,本研究主要詳細(xì)研究vlp7個家族成員的黏附宿主細(xì)胞功能,特別是其Ⅲ區(qū)重復(fù)片段重復(fù)次數(shù)變化對其黏附能力的影響。根據(jù)GenBank中已公布的vlp各個家族的基因序列,設(shè)計引物,利用PCR擴(kuò)增獲得vlp基因,或者人工合成Ⅲ區(qū)重復(fù)片段重復(fù)次數(shù)不等的一系列vlp基因,均克隆于pET-32a(+)進(jìn)行表達(dá),獲得目的蛋白。同時利用固相合成法分別制備vlp各個家族的Ⅲ區(qū)重復(fù)肽段。用間接免疫熒光試驗和微孔板黏附試驗鑒定系列vlp重組蛋白和肽段的黏附功能。通過誘導(dǎo)表達(dá)和鎳柱親和層析純化,成功獲得純度較高的各個目的重組蛋白。利用間接免疫熒光試驗證實了vlp各家族混合蛋白vlpmix參與介導(dǎo)豬鼻支原體黏附宿主細(xì)胞；利用微孔板黏附試驗定量檢測vlp各個家族不含Ⅲ區(qū)肽段和含有重復(fù)次數(shù)為3、6、9、12次的vlp重組蛋白,以及Ⅲ區(qū)重復(fù)肽段的黏附能力,結(jié)果表明Ⅱ區(qū)中含有明顯的黏附表位,vlpB和vlpG家族的Ⅲ區(qū)重復(fù)肽段有明顯黏附功能,其他家族Ⅲ區(qū)重復(fù)肽段沒有明顯黏附功能；vlp各家族的黏附能力都與其Ⅲ區(qū)重復(fù)次數(shù)有關(guān),且隨著重復(fù)次數(shù)增多,黏附能力下降。本研究結(jié)果有助于進(jìn)一步研究豬鼻支原體的黏附及致病機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：豬鼻支原體 可變脂蛋白(vlp) 細(xì)胞黏附
【學(xué)位授予單位】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.62
【目錄】：

• 摘要8-9
• 文獻(xiàn)綜述9-14
• 1 豬鼻支原體研究進(jìn)展9-11
• 1.1 形態(tài)特征9
• 1.2 培養(yǎng)特征9-10
• 1.3 豬鼻支原體的致病機(jī)制10-11
• 2 豬鼻支原體表面可變脂蛋白家族——vlp家族11-13
• 2.1 支原體表面可變蛋白與細(xì)胞黏附12-13
• 2.2 蛋白重復(fù)序列區(qū)重復(fù)次數(shù)的變化可能與功能有關(guān)13
• 3 本研究的創(chuàng)新點和實踐意義13-14
• 3.1 創(chuàng)新和特色13
• 3.2 科學(xué)和實踐意義13-14
• 試驗一 豬鼻支原體vlp各家族混合蛋白黏附細(xì)胞實驗14-27
• 1 引言14-15
• 2 試驗材料15-19
• 2.1 細(xì)胞和菌種15
• 2.2 主要試劑15
• 2.3 主要儀器15
• 2.4 主要溶液配制15-19
• 3 試驗方法19-21
• 3.1 豬鼻支原體重組蛋白vlpX的表達(dá)和純化19-20
• 3.2 混合重組蛋白vlpmix黏附STEC細(xì)胞試驗20-21
• 4 結(jié)果與分析21-26
• 4.1 重組蛋白vlpX重組蛋白的表達(dá)和純化21-22
• 4.2 重組蛋白的Western Blot鑒定22-23
• 4.3 混合重組蛋白vlpmix黏附STEC和PK-15細(xì)胞試驗23-26
• 5 小結(jié)26-27
• 試驗二 豬鼻支原體表面可變蛋白vlp參與介導(dǎo)黏附宿主細(xì)胞功能區(qū)域鑒定27-37
• 1 引言27
• 2 試驗材料27-28
• 2.1 菌株及人工合成短肽27
• 2.2 主要試劑27
• 2.3 主要儀器27-28
• 2.4 主要溶液及配制28
• 3 試驗方法28-34
• 3.1 7種不含Ⅲ區(qū)重復(fù)片段的重組蛋白vlpX0的構(gòu)建28-32
• 3.2 重組蛋白vlpXO的表達(dá)和純化32
• 3.3 KLH-PepvlpX偶聯(lián)蛋白的獲得32
• 3.4 微孔板黏附試驗定量檢測重組蛋白和合成短肽黏附細(xì)胞能力32-34
• 4 結(jié)果與分析34-36
• 4.1 7種不含Ⅲ區(qū)重復(fù)片段的重組蛋白表達(dá)純化34-35
• 4.2 不含Ⅲ區(qū)重復(fù)片段的重組蛋白vlpX0黏附細(xì)胞35
• 4.3 KLH-PepvlpX偶聯(lián)蛋白黏附細(xì)胞35-36
• 5 小結(jié)36-37
• 試驗三 vlpⅢ區(qū)重復(fù)次數(shù)差異對黏附能力的影響37-45
• 1 引言37
• 2 試驗材料37-38
• 2.1 細(xì)胞和菌株37
• 2.2 主要試劑37
• 2.3 主要儀器37-38
• 2.4 主要溶液及配制38
• 3 試驗方法38-39
• 3.1 不同Ⅲ區(qū)重復(fù)片段的重組蛋白的構(gòu)建38
• 3.2 重組蛋白vlpXn的表達(dá)和純化38-39
• 3.3 Westem Blot鑒定重組蛋白反應(yīng)原性39
• 3.4 STEC和PK-15細(xì)胞膜蛋白制備39
• 3.5 微孔板黏附試驗定量檢測重組蛋白黏附細(xì)胞能力39
• 3.6 微孔板黏附試驗結(jié)果數(shù)據(jù)處理39
• 4 試驗結(jié)果39-44
• 4.1 重組質(zhì)粒pET-32a(+)/vlpXn的PCR鑒定39-40
• 4.2 重組蛋白vlpXn的表達(dá)純化和Western Blot鑒定40-43
• 4.3 重組蛋白vlpXn黏附細(xì)胞結(jié)果43-44
• 5 小結(jié)44-45
• 討論45-47
• 1 支原體的黏附因子45
• 2 支原體的表面可變蛋白45
• 3 vlp黏附功能區(qū)鑒定及Ⅲ區(qū)重復(fù)次數(shù)的影響45-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-52
• Abstract52-54
• 致謝54

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本文編號：966919