本文關鍵詞：小尾寒羊ANKRD2基因的克隆、結構特征與表達分析

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【摘要】：錨定重復蛋白(muscle specific ankyrin repeat proteins-MARPs)家族是由三個保守的成員組成:心肌錨定重復蛋白(Ankyin repeat domain 1,ANKRD1)、骨骼肌錨定重復蛋白(Ankyin repeat domain 2,ANKRD2)和錨定重復蛋白23(Ankyin repeat domain23,ANKRD23)。本試驗根據(jù)實驗室前期小尾寒羊和杜泊羊臂二頭肌轉錄組測序數(shù)據(jù),對兩個轉錄本差異表達基因進行篩選,挖掘到差異表達基因ANKRD2為本研究的目的基因。ANKRD2基因特異性表達于骨骼肌,在骨骼肌生長發(fā)育過程中起重要作用,參與肌細胞的分化與肌纖維的形成和成熟。目前關于小尾寒羊ANKRD2的核酸序列、分子結構和組織表達尚未見報道。本研究克隆了小尾寒羊ANKRD2基因的全長cDNA序列并對其編碼的蛋白進行了一系列的生物信息學分析,在mRNA水平和蛋白水平上對小尾寒羊和杜泊羊的組織表達進行了分析。主要研究結果如下:(1)小尾寒羊ANKRD2基因全長cDNA序列的克隆使用RT-PCR,5′RACE和3′RACE法,其全長1179 bp,包含990 bp的開放閱讀框、21 bp的5′非編碼區(qū)(5′UTR)和168 bp的3′非編碼區(qū)(3′UTR)。其中,開放閱讀框編碼329個氨基酸的多肽鏈。我們克隆該基因并將其提交在Genbank上,登陸號是KR090892。在NCBI上下載該基因的預測序列,與我們克隆的序列進行比對,發(fā)現(xiàn)相似率約99.40%,CDS區(qū)存在2個堿基突變位點。(2)生物信息學分析顯示,ANKRD2基因編碼的蛋白分子量為36.7 kDa,脂溶指數(shù)為87.48(60),蛋白的流動性較大。不穩(wěn)定指數(shù)為49.57(40),蛋白的穩(wěn)定性一般。疏水性指數(shù)為-0.6,說明它為水溶性蛋白,且親水性較好。等電點為5.72,為偏酸性蛋白,氨基酸組分最多的是谷氨酸。預測蛋白質的二級結構是α螺旋和無規(guī)則卷曲。生物信息學軟件分析發(fā)現(xiàn)其C值、S值和Y值均小于0.5,推斷其不含有蛋白信號肽,屬于非跨膜蛋白,故不能被分泌到細胞外發(fā)揮作用。在氨基酸序列中,發(fā)現(xiàn)14個磷酸化位點,12個泛素化位點,10個糖基化位點,4個錨定重復結構域。利用Swiss-model軟件預測發(fā)現(xiàn)模型ANK-N5C-317(4o60.1.A)與我們所研究的蛋白擁有最相似的三級結構。(3)將獲得的小尾寒羊該基因編碼的氨基酸序列與其他物種的氨基酸序列進行同源性分析,發(fā)現(xiàn)小尾寒羊ANKRD2氨基酸與所選物種的相似性均在86%以上,說明該蛋白在哺乳動物中高度保守,系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)綿羊的遺傳距離與山羊、牛、馬相距較近,與人類、豬、鼠、虎鯨的遺傳距離相距較遠。(4)通過熒光定量PCR和Western-blot技術分析該基因在小尾寒羊和杜泊羊不同的組織間的表達情況,發(fā)現(xiàn)該基因在小尾寒羊和杜泊羊中均呈現(xiàn)出組織表達差異性。研究發(fā)現(xiàn)該基因主要在小尾寒羊和杜泊羊的骨骼肌中表達,在骨骼肌中的表達量最高,顯著高于其他組織(p0.05)。此外,在骨骼肌組織中,杜泊羊ANKRD2蛋白表達量顯著高于小尾寒羊的(p0.05),在其他組織中,蛋白表達量無顯著差異。綜上所述,本研究從mRNA水平和蛋白水平對小尾寒羊ANKRD2基因展開了較為系統(tǒng)的研究,并且驗證了小尾寒羊ANKRD2基因在小尾寒羊和杜泊羊不同組織中的表達情況,為地方品種小尾寒羊經(jīng)濟性狀的改良和分子育種提供理論依據(jù)。
【關鍵詞】：小尾寒羊 ANKRD2 克隆和序列分析 組織表達
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S826
【目錄】：

• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 1 前言12-19
• 1.1 哺乳動物肌纖維類型對骨骼肌的影響12-14
• 1.1.1 肌纖維的類型12
• 1.1.2 肌纖維類型與肌肉產(chǎn)量的關系12-14
• 1.2 骨骼肌的形成及分化機制14-15
• 1.2.1 骨骼肌的組成14
• 1.2.2 骨骼肌的形成和分化機制14-15
• 1.3 ANKRD2基因的研究進展15-17
• 1.4 小尾寒羊和杜泊羊的品種特征及生長性能比較17-18
• 1.4.1 品種特征比較17
• 1.4.2 生長性能比較17-18
• 1.5 本研究的目的及意義18-19
• 2 材料與方法19-43
• 2.1 試驗材料19-23
• 2.1.1 試驗動物與樣品采集19
• 2.1.2 主要試劑與來源19-20
• 2.1.3 主要儀器及來源20-21
• 2.1.4 常用試劑的配制21-23
• 2.2 試驗方法23-43
• 2.2.1 基因篩選、引物設計23-24
• 2.2.2 總RNA的提取、檢測及cDNA合成24-26
• 2.2.3 小尾寒羊ANKRD2基因克隆測序26-37
• 2.2.4 生物信息學分析和系統(tǒng)進化分析37-38
• 2.2.5 小尾寒羊和杜泊羊ANKRD2基因的熒光定量PCR分析38-39
• 2.2.6 小尾寒羊和杜泊羊ANKRD2蛋白的免疫印跡分析39-43
• 3 結果與分析43-64
• 3.1 克隆測序與核苷酸序列分析43-48
• 3.1.1 總RNA的提取43
• 3.1.2 ANKRD2基因特異性片段的擴增及測序43-44
• 3.1.3 ANKRD2基因 3' RACE擴增及其測序44-45
• 3.1.4 ANKRD2基因 5' RACE擴增及其測序45-46
• 3.1.5 cDNA序列分析46-47
• 3.1.6 預測序列與克隆所得序列進行比對47
• 3.1.7 ANKRD2基因CpG島預測及甲基化分析47-48
• 3.2 氨基酸序列分析與蛋白的功能預測48-55
• 3.2.1 蛋白的基本性質48-49
• 3.2.2 蛋白的二級結構預測49-50
• 3.2.3 蛋白信號肽預測50-51
• 3.2.4 蛋白磷酸化位點預測51-52
• 3.2.5 蛋白糖基化位點預測52-53
• 3.2.6 蛋白泛素化預測53-54
• 3.2.7 蛋白結構域預測54-55
• 3.2.8 蛋白三級結構預測55
• 3.3 蛋白氨基酸序列的同源性和系統(tǒng)進化分析55-57
• 3.3.1 多物種骨骼肌錨定重復蛋白基因氨基酸序列的同源性比對55-56
• 3.3.2 多物種骨骼肌錨定重復蛋白基因氨基酸序列的系統(tǒng)進化分析56-57
• 3.4 小尾寒羊與杜泊羊ANKRD2基因mRNA的組織特異性表達分析57-61
• 3.4.1 熒光定量PCR標準曲線的建立與分析57-59
• 3.4.2 熒光定量PCR擴增的熔解曲線分析59-60
• 3.4.3 骨骼肌錨定重復蛋白基因mRNA在不同組織中的表達分析60-61
• 3.5 小尾寒羊與杜泊羊骨骼肌錨定重復蛋白的組織特異性表達分析61-64
• 3.5.1 蛋白組織表達的Western-blot結果61-62
• 3.5.2 蛋白在不同組織中的表達特點分析62-64
• 4 討論64-68
• 4.1 ANKRD2結構與功能關系64-65
• 4.2 ANKRD2氨基酸序列進化分析65-66
• 4.3 ANKRD2基因mRNA表達及功能分析66
• 4.4 ANKRD2蛋白表達及功能分析66-68
• 5 結論68-69
• 參考文獻69-76
• 附錄76-77
• 致謝77

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 趙曉;莫德林;張悅;龔雯;李安寧;陳瑤生;;豬的骨骼肌生長發(fā)育研究進展[J];生命科學;2011年01期

2 蔣瑤;陳其兵;;植物CBF1轉錄因子的生物信息學分析[J];林業(yè)科學;2010年06期

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本文編號：949878