本文關(guān)鍵詞：小尾寒羊ANKRD2基因的克隆、結(jié)構(gòu)特征與表達(dá)分析

  更多相關(guān)文章： 小尾寒羊 ANKRD2 克隆和序列分析 組織表達(dá)

【摘要】：錨定重復(fù)蛋白(muscle specific ankyrin repeat proteins-MARPs)家族是由三個(gè)保守的成員組成:心肌錨定重復(fù)蛋白(Ankyin repeat domain 1,ANKRD1)、骨骼肌錨定重復(fù)蛋白(Ankyin repeat domain 2,ANKRD2)和錨定重復(fù)蛋白23(Ankyin repeat domain23,ANKRD23)。本試驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期小尾寒羊和杜泊羊臂二頭肌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù),對(duì)兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選,挖掘到差異表達(dá)基因ANKRD2為本研究的目的基因。ANKRD2基因特異性表達(dá)于骨骼肌,在骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育過程中起重要作用,參與肌細(xì)胞的分化與肌纖維的形成和成熟。目前關(guān)于小尾寒羊ANKRD2的核酸序列、分子結(jié)構(gòu)和組織表達(dá)尚未見報(bào)道。本研究克隆了小尾寒羊ANKRD2基因的全長(zhǎng)cDNA序列并對(duì)其編碼的蛋白進(jìn)行了一系列的生物信息學(xué)分析,在mRNA水平和蛋白水平上對(duì)小尾寒羊和杜泊羊的組織表達(dá)進(jìn)行了分析。主要研究結(jié)果如下:(1)小尾寒羊ANKRD2基因全長(zhǎng)cDNA序列的克隆使用RT-PCR,5′RACE和3′RACE法,其全長(zhǎng)1179 bp,包含990 bp的開放閱讀框、21 bp的5′非編碼區(qū)(5′UTR)和168 bp的3′非編碼區(qū)(3′UTR)。其中,開放閱讀框編碼329個(gè)氨基酸的多肽鏈。我們克隆該基因并將其提交在Genbank上,登陸號(hào)是KR090892。在NCBI上下載該基因的預(yù)測(cè)序列,與我們克隆的序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)相似率約99.40%,CDS區(qū)存在2個(gè)堿基突變位點(diǎn)。(2)生物信息學(xué)分析顯示,ANKRD2基因編碼的蛋白分子量為36.7 kDa,脂溶指數(shù)為87.48(60),蛋白的流動(dòng)性較大。不穩(wěn)定指數(shù)為49.57(40),蛋白的穩(wěn)定性一般。疏水性指數(shù)為-0.6,說明它為水溶性蛋白,且親水性較好。等電點(diǎn)為5.72,為偏酸性蛋白,氨基酸組分最多的是谷氨酸。預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是α螺旋和無規(guī)則卷曲。生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)其C值、S值和Y值均小于0.5,推斷其不含有蛋白信號(hào)肽,屬于非跨膜蛋白,故不能被分泌到細(xì)胞外發(fā)揮作用。在氨基酸序列中,發(fā)現(xiàn)14個(gè)磷酸化位點(diǎn),12個(gè)泛素化位點(diǎn),10個(gè)糖基化位點(diǎn),4個(gè)錨定重復(fù)結(jié)構(gòu)域。利用Swiss-model軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)模型ANK-N5C-317(4o60.1.A)與我們所研究的蛋白擁有最相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)。(3)將獲得的小尾寒羊該基因編碼的氨基酸序列與其他物種的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析,發(fā)現(xiàn)小尾寒羊ANKRD2氨基酸與所選物種的相似性均在86%以上,說明該蛋白在哺乳動(dòng)物中高度保守,系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)綿羊的遺傳距離與山羊、牛、馬相距較近,與人類、豬、鼠、虎鯨的遺傳距離相距較遠(yuǎn)。(4)通過熒光定量PCR和Western-blot技術(shù)分析該基因在小尾寒羊和杜泊羊不同的組織間的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)該基因在小尾寒羊和杜泊羊中均呈現(xiàn)出組織表達(dá)差異性。研究發(fā)現(xiàn)該基因主要在小尾寒羊和杜泊羊的骨骼肌中表達(dá),在骨骼肌中的表達(dá)量最高,顯著高于其他組織(p0.05)。此外,在骨骼肌組織中,杜泊羊ANKRD2蛋白表達(dá)量顯著高于小尾寒羊的(p0.05),在其他組織中,蛋白表達(dá)量無顯著差異。綜上所述,本研究從mRNA水平和蛋白水平對(duì)小尾寒羊ANKRD2基因展開了較為系統(tǒng)的研究,并且驗(yàn)證了小尾寒羊ANKRD2基因在小尾寒羊和杜泊羊不同組織中的表達(dá)情況,為地方品種小尾寒羊經(jīng)濟(jì)性狀的改良和分子育種提供理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：小尾寒羊 ANKRD2 克隆和序列分析 組織表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S826
【目錄】：

• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 1 前言12-19
• 1.1 哺乳動(dòng)物肌纖維類型對(duì)骨骼肌的影響12-14
• 1.1.1 肌纖維的類型12
• 1.1.2 肌纖維類型與肌肉產(chǎn)量的關(guān)系12-14
• 1.2 骨骼肌的形成及分化機(jī)制14-15
• 1.2.1 骨骼肌的組成14
• 1.2.2 骨骼肌的形成和分化機(jī)制14-15
• 1.3 ANKRD2基因的研究進(jìn)展15-17
• 1.4 小尾寒羊和杜泊羊的品種特征及生長(zhǎng)性能比較17-18
• 1.4.1 品種特征比較17
• 1.4.2 生長(zhǎng)性能比較17-18
• 1.5 本研究的目的及意義18-19
• 2 材料與方法19-43
• 2.1 試驗(yàn)材料19-23
• 2.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集19
• 2.1.2 主要試劑與來源19-20
• 2.1.3 主要儀器及來源20-21
• 2.1.4 常用試劑的配制21-23
• 2.2 試驗(yàn)方法23-43
• 2.2.1 基因篩選、引物設(shè)計(jì)23-24
• 2.2.2 總RNA的提取、檢測(cè)及cDNA合成24-26
• 2.2.3 小尾寒羊ANKRD2基因克隆測(cè)序26-37
• 2.2.4 生物信息學(xué)分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析37-38
• 2.2.5 小尾寒羊和杜泊羊ANKRD2基因的熒光定量PCR分析38-39
• 2.2.6 小尾寒羊和杜泊羊ANKRD2蛋白的免疫印跡分析39-43
• 3 結(jié)果與分析43-64
• 3.1 克隆測(cè)序與核苷酸序列分析43-48
• 3.1.1 總RNA的提取43
• 3.1.2 ANKRD2基因特異性片段的擴(kuò)增及測(cè)序43-44
• 3.1.3 ANKRD2基因 3' RACE擴(kuò)增及其測(cè)序44-45
• 3.1.4 ANKRD2基因 5' RACE擴(kuò)增及其測(cè)序45-46
• 3.1.5 cDNA序列分析46-47
• 3.1.6 預(yù)測(cè)序列與克隆所得序列進(jìn)行比對(duì)47
• 3.1.7 ANKRD2基因CpG島預(yù)測(cè)及甲基化分析47-48
• 3.2 氨基酸序列分析與蛋白的功能預(yù)測(cè)48-55
• 3.2.1 蛋白的基本性質(zhì)48-49
• 3.2.2 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)49-50
• 3.2.3 蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)50-51
• 3.2.4 蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)51-52
• 3.2.5 蛋白糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)52-53
• 3.2.6 蛋白泛素化預(yù)測(cè)53-54
• 3.2.7 蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)54-55
• 3.2.8 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)55
• 3.3 蛋白氨基酸序列的同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析55-57
• 3.3.1 多物種骨骼肌錨定重復(fù)蛋白基因氨基酸序列的同源性比對(duì)55-56
• 3.3.2 多物種骨骼肌錨定重復(fù)蛋白基因氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析56-57
• 3.4 小尾寒羊與杜泊羊ANKRD2基因mRNA的組織特異性表達(dá)分析57-61
• 3.4.1 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立與分析57-59
• 3.4.2 熒光定量PCR擴(kuò)增的熔解曲線分析59-60
• 3.4.3 骨骼肌錨定重復(fù)蛋白基因mRNA在不同組織中的表達(dá)分析60-61
• 3.5 小尾寒羊與杜泊羊骨骼肌錨定重復(fù)蛋白的組織特異性表達(dá)分析61-64
• 3.5.1 蛋白組織表達(dá)的Western-blot結(jié)果61-62
• 3.5.2 蛋白在不同組織中的表達(dá)特點(diǎn)分析62-64
• 4 討論64-68
• 4.1 ANKRD2結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系64-65
• 4.2 ANKRD2氨基酸序列進(jìn)化分析65-66
• 4.3 ANKRD2基因mRNA表達(dá)及功能分析66
• 4.4 ANKRD2蛋白表達(dá)及功能分析66-68
• 5 結(jié)論68-69
• 參考文獻(xiàn)69-76
• 附錄76-77
• 致謝77

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 趙曉;莫德林;張悅;龔雯;李安寧;陳瑤生;;豬的骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育研究進(jìn)展[J];生命科學(xué);2011年01期

2 蔣瑤;陳其兵;;植物CBF1轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學(xué)分析[J];林業(yè)科學(xué);2010年06期

，

本文編號(hào)：949878