發(fā)布時(shí)間：2017-09-29 03:13

  本文關(guān)鍵詞：新疆巴什拜羊重組SPLUNC1蛋白的體外生物學(xué)功能研究

  更多相關(guān)文章： 短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆基因1 巴什拜羊 綿羊肺炎支原體 抑菌活性 中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶 細(xì)胞凋亡

【摘要】：短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆基因1(short palate,lung and nasal epithelium clone 1,SPLUNC1)是特異高表達(dá)于呼吸道中的一種分泌蛋白,參與機(jī)體免疫防御功能,具有抗感染、清除有害微生物、抑癌、抗腫瘤的作用。SPLUNC1作為一種天然保護(hù)性免疫蛋白,對(duì)維持上呼吸道的正常生理活動(dòng)起著重要作用。但目前對(duì)SPLUNC1的研究多集中在人和小鼠上,未見(jiàn)綿羊SPLUNC1基因功能研究報(bào)導(dǎo)。目的:本實(shí)驗(yàn)在成功表達(dá)巴什拜羊重組SPLUNC1蛋白(rSPLUNC1)的基礎(chǔ)上,對(duì)rSPLUNC1進(jìn)行了蛋白純化及western blot檢測(cè),并進(jìn)一步研究rSPLUNC1對(duì)綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)增殖的影響、對(duì)部分病原菌抑菌活性的影響、對(duì)中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(Neutrophil elastase,NE)活性的調(diào)節(jié)作用及誘導(dǎo)感染細(xì)菌的外周淋巴細(xì)胞凋亡的影響,為研究rSPLUNC1的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。方法:(1)rSPLUNC1的純化及Western blot檢測(cè):利用課題組已構(gòu)建好的巴什拜羊重組巴斯德畢赤酵母GS115/pPIC9K-SPLUNC1陽(yáng)性克隆株,甲醇誘導(dǎo)表達(dá)96h,采用Ni-NTA瓊脂糖親和層析純化,Western blot方法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。(2)rSPLUNC1對(duì)Mo增殖的影響:采用平板菌落計(jì)數(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR兩種方法檢測(cè)3種不同濃度rSPLUNC1(10μg/mL、20μg/m L、40μg/m L)對(duì)Mo菌落生長(zhǎng)及Mo 16S rRNA增殖的影響。用體視顯微鏡觀察計(jì)數(shù)單菌落觀察菌落生長(zhǎng)情況,并利用熒光定量PCR檢測(cè)Mo 16S rRNA的拷貝數(shù)。(3)rSPLUNC1對(duì)肺部病原菌的抑菌活性:采用微量稀釋法測(cè)定不同溶度rSPLUNC1(40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml)對(duì)巴氏桿菌、大腸桿菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌4種菌的抑菌活性。在96孔板內(nèi)將rSPLUNC1與測(cè)試菌培養(yǎng),分別在0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h測(cè)定菌液的OD600。(4)rSPLUNC1對(duì)NE活性的調(diào)節(jié)作用:用顯色底物法檢測(cè)3種不同濃度的rSPLUNC1(40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml)對(duì)NE活性的調(diào)節(jié)作用。將中性粒細(xì)胞與Mo和rSPLUNC1共同培養(yǎng)2h,再于96孔板加入2 mmol/L四肽底物37℃孵育5min后用酶標(biāo)儀測(cè)定OD405nm值。(5)rSPLUNC1對(duì)外周淋巴細(xì)胞凋亡的影響:將淋巴細(xì)胞分別感染Mo、巴氏桿菌、肺炎鏈球菌3種呼吸道病菌,再加入rSPLUNC1,利用熒光雙染法檢測(cè)淋巴細(xì)胞凋亡情況,進(jìn)一步用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)細(xì)胞凋亡的DNA Ladder。結(jié)果和結(jié)論:(1)rSPLUNC1經(jīng)純化后,雜蛋白大大減少,SDS-PAGE分析可見(jiàn)蛋白分子量大小為25.53kDa的目的條帶;Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)可以與抗His標(biāo)簽的鼠單克隆抗體特異性結(jié)合的目的條帶,蛋白條帶單一,大小為25.53Kda,說(shuō)明表達(dá)的蛋白為目的蛋白。(2)平板菌落計(jì)數(shù)中,10μg/mL、20μg/mL、40μg/m L rSPLUNC1濃度組菌落數(shù)分別比對(duì)照組減少37.25%(p0.01)、48.74%(p0.01)、67.23%(p0.01);熒光定量PCR中,自2 h起,實(shí)驗(yàn)組Mo 16S rRNA拷貝數(shù)降低,4 h時(shí)拷貝數(shù)最低,10μg/m L、20μg/m L、40μg/mL rSPLUNC1濃度組的拷貝數(shù)比對(duì)照組降低2.96%(p0.05)、92.57%(p0.01)、93.75%(p0.01)。研究表明,rSPLUNC1對(duì)體外培養(yǎng)的Mo具有顯著的抑制作用。(3)rSPLUNC1極顯著抑制巴氏桿菌、大腸桿菌的生長(zhǎng),在設(shè)定濃度內(nèi)(10-40μg/ml)且呈劑量效應(yīng),而對(duì)肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)沒(méi)有抑制效果。說(shuō)明rSPLUNC1能夠抑制巴氏桿菌等革蘭氏陰性菌。(4)10μg/ml rSPLUNC1顯著提高M(jìn)o感染的外周中性粒細(xì)胞NE的活性(p0.05),20~40μg/ml rSPLUNC1極顯著地提高M(jìn)o感染的外周中性粒細(xì)胞NE的活性(p0.01,p0.01)。說(shuō)明rSPLUNC1能夠調(diào)節(jié)NE活性,對(duì)抗呼吸道感染具有重要意義。(5)采用熒光雙染法未見(jiàn)有細(xì)胞凋亡的綠色熒光信號(hào),瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)也未見(jiàn)細(xì)胞凋亡的特征性DNA Ladder條帶。說(shuō)明SPLUNC1沒(méi)有誘導(dǎo)感染病原菌的淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡。
【關(guān)鍵詞】：短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆基因1 巴什拜羊 綿羊肺炎支原體 抑菌活性 中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S826
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 主要縮略詞10-14
• 引言14-15
• 第一章 文獻(xiàn)綜述15-25
• 1 SPLUNC1的研究進(jìn)展15-17
• 1.1 SPLUNC1的發(fā)現(xiàn)及分布15
• 1.2 SPLUNC1的分子結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理15-16
• 1.3 SPLUNC1的生物學(xué)功能16-17
• 2 巴什拜羊的生物學(xué)特性17-18
• 3 蛋白質(zhì)分離與純化技術(shù)研究進(jìn)展18-20
• 3.1 根據(jù)蛋白質(zhì)的物理特性進(jìn)行分離純化的技術(shù)18-19
• 3.2 根據(jù)蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性進(jìn)行分離純化的技術(shù)19
• 3.3 其他分離純化技術(shù)19-20
• 4 中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的研究進(jìn)展20-21
• 4.1 NE的生物學(xué)特點(diǎn)20
• 4.2 NE與疾病的關(guān)系20-21
• 4.3 NE的檢測(cè)方法21
• 5 細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展21-25
• 5.1 細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)途徑及調(diào)控21-23
• 5.2 細(xì)胞凋亡引起的細(xì)胞變化23
• 5.3 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)途徑23-25
• 第二章 rSPLUNC1的表達(dá)及純化25-32
• 1 材料與方法26-29
• 1.1 實(shí)驗(yàn)菌株26
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑26
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器26
• 1.4 培養(yǎng)基及其他試劑配制26-28
• 1.5 實(shí)驗(yàn)方法28-29
• 2 結(jié)果29-31
• 2.1 rSPLUNC1的SDS-PAGE檢測(cè)29-30
• 2.2 rSPLUNC1的純化SDS-PAGE檢測(cè)30
• 2.3 rSPLUNC1的Western blot鑒定30-31
• 3 討論31-32
• 第三章 rSPLUNC1對(duì)體外培養(yǎng)的Mo生長(zhǎng)的影響32-44
• 1 材料與方法32-37
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料32-33
• 1.2 平板菌落計(jì)數(shù)測(cè)定rSPLUNC1對(duì)Mo菌落生長(zhǎng)的影響33
• 1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)rSPLUNC1對(duì)Mo 16sRNA增殖的影響33-37
• 1.4 數(shù)據(jù)處理37
• 2 結(jié)果37-42
• 2.1 平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果37-38
• 2.2 Mo 16SrRNA基因擴(kuò)增結(jié)果38-39
• 2.3 質(zhì)粒PCR結(jié)果39
• 2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立39-41
• 2.5 Mo 16SrRNA定量結(jié)果分析41-42
• 3 討論42-44
• 第四章 rSPLUNC1對(duì)呼吸道致病菌的抑制作用44-49
• 1 材料與方法44-45
• 1.1 主要實(shí)驗(yàn)菌株44-45
• 1.2 主要試劑、材料及儀器45
• 1.3 rSPLUNC1對(duì)細(xì)菌的抑制作用45
• 1.4 數(shù)據(jù)處理45
• 2 結(jié)果45-48
• 2.1 rSPLUNC1對(duì)巴氏桿菌（Pm）的抑菌效果45-46
• 2.2 rSPLUNC1對(duì)大腸桿菌（E.coli）的抑菌效果46-47
• 2.3 rSPLUNC1對(duì)肺炎鏈球菌（Sp）的抑菌效果47
• 2.4 rSPLUNC1對(duì)金黃色葡萄球菌（Sa）的作用47-48
• 3 討論48-49
• 第五章 rSPLUNC1對(duì)中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的影響49-54
• 1 材料與方法49-51
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料49-50
• 1.2 rSPLUNC1對(duì)NE活性的調(diào)節(jié)作用50-51
• 1.3 數(shù)據(jù)處理51
• 2 結(jié)果51-52
• 2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立51-52
• 2.2 rSPLUNC1對(duì)NE活性的調(diào)節(jié)作用52
• 3 討論52-54
• 第六章 rSPLUNC1對(duì)淋巴細(xì)胞凋亡的影響54-60
• 1 材料與方法54-56
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料54-55
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法55-56
• 1.3 數(shù)據(jù)處理56
• 2 結(jié)果56-58
• 2.1 DNA ladder檢測(cè)凋亡結(jié)果56-57
• 2.2 Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果57-58
• 3 討論58-60
• 全文總結(jié)60
• 創(chuàng)新點(diǎn)60-61
• 參考文獻(xiàn)61-71
• 致謝71-72
• 作者簡(jiǎn)介72-73
• 石河子大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文導(dǎo)師評(píng)閱表73

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本文編號(hào)：939642