本文關鍵詞：新疆巴什拜羊重組SPLUNC1蛋白的體外生物學功能研究

  更多相關文章： 短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆基因1 巴什拜羊 綿羊肺炎支原體 抑菌活性 中性粒細胞彈性蛋白酶 細胞凋亡

【摘要】：短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆基因1(short palate,lung and nasal epithelium clone 1,SPLUNC1)是特異高表達于呼吸道中的一種分泌蛋白,參與機體免疫防御功能,具有抗感染、清除有害微生物、抑癌、抗腫瘤的作用。SPLUNC1作為一種天然保護性免疫蛋白,對維持上呼吸道的正常生理活動起著重要作用。但目前對SPLUNC1的研究多集中在人和小鼠上,未見綿羊SPLUNC1基因功能研究報導。目的:本實驗在成功表達巴什拜羊重組SPLUNC1蛋白(rSPLUNC1)的基礎上,對rSPLUNC1進行了蛋白純化及western blot檢測,并進一步研究rSPLUNC1對綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)增殖的影響、對部分病原菌抑菌活性的影響、對中性粒細胞彈性蛋白酶(Neutrophil elastase,NE)活性的調(diào)節(jié)作用及誘導感染細菌的外周淋巴細胞凋亡的影響,為研究rSPLUNC1的生物學功能奠定基礎。方法:(1)rSPLUNC1的純化及Western blot檢測:利用課題組已構建好的巴什拜羊重組巴斯德畢赤酵母GS115/pPIC9K-SPLUNC1陽性克隆株,甲醇誘導表達96h,采用Ni-NTA瓊脂糖親和層析純化,Western blot方法檢測目的蛋白的表達。(2)rSPLUNC1對Mo增殖的影響:采用平板菌落計數(shù)和實時熒光定量PCR兩種方法檢測3種不同濃度rSPLUNC1(10μg/mL、20μg/m L、40μg/m L)對Mo菌落生長及Mo 16S rRNA增殖的影響。用體視顯微鏡觀察計數(shù)單菌落觀察菌落生長情況,并利用熒光定量PCR檢測Mo 16S rRNA的拷貝數(shù)。(3)rSPLUNC1對肺部病原菌的抑菌活性:采用微量稀釋法測定不同溶度rSPLUNC1(40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml)對巴氏桿菌、大腸桿菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌4種菌的抑菌活性。在96孔板內(nèi)將rSPLUNC1與測試菌培養(yǎng),分別在0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h測定菌液的OD600。(4)rSPLUNC1對NE活性的調(diào)節(jié)作用:用顯色底物法檢測3種不同濃度的rSPLUNC1(40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml)對NE活性的調(diào)節(jié)作用。將中性粒細胞與Mo和rSPLUNC1共同培養(yǎng)2h,再于96孔板加入2 mmol/L四肽底物37℃孵育5min后用酶標儀測定OD405nm值。(5)rSPLUNC1對外周淋巴細胞凋亡的影響:將淋巴細胞分別感染Mo、巴氏桿菌、肺炎鏈球菌3種呼吸道病菌,再加入rSPLUNC1,利用熒光雙染法檢測淋巴細胞凋亡情況,進一步用瓊脂糖凝膠電泳檢測細胞凋亡的DNA Ladder。結果和結論:(1)rSPLUNC1經(jīng)純化后,雜蛋白大大減少,SDS-PAGE分析可見蛋白分子量大小為25.53kDa的目的條帶;Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)可以與抗His標簽的鼠單克隆抗體特異性結合的目的條帶,蛋白條帶單一,大小為25.53Kda,說明表達的蛋白為目的蛋白。(2)平板菌落計數(shù)中,10μg/mL、20μg/mL、40μg/m L rSPLUNC1濃度組菌落數(shù)分別比對照組減少37.25%(p0.01)、48.74%(p0.01)、67.23%(p0.01);熒光定量PCR中,自2 h起,實驗組Mo 16S rRNA拷貝數(shù)降低,4 h時拷貝數(shù)最低,10μg/m L、20μg/m L、40μg/mL rSPLUNC1濃度組的拷貝數(shù)比對照組降低2.96%(p0.05)、92.57%(p0.01)、93.75%(p0.01)。研究表明,rSPLUNC1對體外培養(yǎng)的Mo具有顯著的抑制作用。(3)rSPLUNC1極顯著抑制巴氏桿菌、大腸桿菌的生長,在設定濃度內(nèi)(10-40μg/ml)且呈劑量效應,而對肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌的生長沒有抑制效果。說明rSPLUNC1能夠抑制巴氏桿菌等革蘭氏陰性菌。(4)10μg/ml rSPLUNC1顯著提高Mo感染的外周中性粒細胞NE的活性(p0.05),20~40μg/ml rSPLUNC1極顯著地提高Mo感染的外周中性粒細胞NE的活性(p0.01,p0.01)。說明rSPLUNC1能夠調(diào)節(jié)NE活性,對抗呼吸道感染具有重要意義。(5)采用熒光雙染法未見有細胞凋亡的綠色熒光信號,瓊脂糖凝膠電泳檢測也未見細胞凋亡的特征性DNA Ladder條帶。說明SPLUNC1沒有誘導感染病原菌的淋巴細胞發(fā)生凋亡。
【關鍵詞】：短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆基因1 巴什拜羊 綿羊肺炎支原體 抑菌活性 中性粒細胞彈性蛋白酶 細胞凋亡
【學位授予單位】：石河子大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S826
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 主要縮略詞10-14
• 引言14-15
• 第一章 文獻綜述15-25
• 1 SPLUNC1的研究進展15-17
• 1.1 SPLUNC1的發(fā)現(xiàn)及分布15
• 1.2 SPLUNC1的分子結構和作用機理15-16
• 1.3 SPLUNC1的生物學功能16-17
• 2 巴什拜羊的生物學特性17-18
• 3 蛋白質(zhì)分離與純化技術研究進展18-20
• 3.1 根據(jù)蛋白質(zhì)的物理特性進行分離純化的技術18-19
• 3.2 根據(jù)蛋白質(zhì)的生物學特性進行分離純化的技術19
• 3.3 其他分離純化技術19-20
• 4 中性粒細胞彈性蛋白酶的研究進展20-21
• 4.1 NE的生物學特點20
• 4.2 NE與疾病的關系20-21
• 4.3 NE的檢測方法21
• 5 細胞凋亡的研究進展21-25
• 5.1 細胞凋亡的信號傳導途徑及調(diào)控21-23
• 5.2 細胞凋亡引起的細胞變化23
• 5.3 細胞凋亡的檢測途徑23-25
• 第二章 rSPLUNC1的表達及純化25-32
• 1 材料與方法26-29
• 1.1 實驗菌株26
• 1.2 實驗試劑26
• 1.3 實驗儀器26
• 1.4 培養(yǎng)基及其他試劑配制26-28
• 1.5 實驗方法28-29
• 2 結果29-31
• 2.1 rSPLUNC1的SDS-PAGE檢測29-30
• 2.2 rSPLUNC1的純化SDS-PAGE檢測30
• 2.3 rSPLUNC1的Western blot鑒定30-31
• 3 討論31-32
• 第三章 rSPLUNC1對體外培養(yǎng)的Mo生長的影響32-44
• 1 材料與方法32-37
• 1.1 實驗材料32-33
• 1.2 平板菌落計數(shù)測定rSPLUNC1對Mo菌落生長的影響33
• 1.3 實時熒光定量PCR檢測rSPLUNC1對Mo 16sRNA增殖的影響33-37
• 1.4 數(shù)據(jù)處理37
• 2 結果37-42
• 2.1 平板菌落計數(shù)結果37-38
• 2.2 Mo 16SrRNA基因擴增結果38-39
• 2.3 質(zhì)粒PCR結果39
• 2.4 標準曲線的建立39-41
• 2.5 Mo 16SrRNA定量結果分析41-42
• 3 討論42-44
• 第四章 rSPLUNC1對呼吸道致病菌的抑制作用44-49
• 1 材料與方法44-45
• 1.1 主要實驗菌株44-45
• 1.2 主要試劑、材料及儀器45
• 1.3 rSPLUNC1對細菌的抑制作用45
• 1.4 數(shù)據(jù)處理45
• 2 結果45-48
• 2.1 rSPLUNC1對巴氏桿菌（Pm）的抑菌效果45-46
• 2.2 rSPLUNC1對大腸桿菌（E.coli）的抑菌效果46-47
• 2.3 rSPLUNC1對肺炎鏈球菌（Sp）的抑菌效果47
• 2.4 rSPLUNC1對金黃色葡萄球菌（Sa）的作用47-48
• 3 討論48-49
• 第五章 rSPLUNC1對中性粒細胞彈性蛋白酶的影響49-54
• 1 材料與方法49-51
• 1.1 實驗材料49-50
• 1.2 rSPLUNC1對NE活性的調(diào)節(jié)作用50-51
• 1.3 數(shù)據(jù)處理51
• 2 結果51-52
• 2.1 標準曲線的建立51-52
• 2.2 rSPLUNC1對NE活性的調(diào)節(jié)作用52
• 3 討論52-54
• 第六章 rSPLUNC1對淋巴細胞凋亡的影響54-60
• 1 材料與方法54-56
• 1.1 實驗材料54-55
• 1.2 實驗方法55-56
• 1.3 數(shù)據(jù)處理56
• 2 結果56-58
• 2.1 DNA ladder檢測凋亡結果56-57
• 2.2 Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測結果57-58
• 3 討論58-60
• 全文總結60
• 創(chuàng)新點60-61
• 參考文獻61-71
• 致謝71-72
• 作者簡介72-73
• 石河子大學碩士研究生學位論文導師評閱表73

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本文編號：939642