發(fā)布時間：2017-09-24 17:33

  本文關(guān)鍵詞：Mybph基因在肌細胞增殖、分化中的調(diào)控作用研究

  更多相關(guān)文章： 骨骼肌 增殖 分化 細胞周期 Mybph 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

【摘要】：肌肉發(fā)育過程是一個十分復(fù)雜的進程,在其發(fā)育過程中受到了很多基因及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。由于肌肉發(fā)育的復(fù)雜性,雖然現(xiàn)在已經(jīng)確定了一批對肌肉發(fā)育有調(diào)控作用的調(diào)控因子,但仍有很多與肌發(fā)育相關(guān)的基因或轉(zhuǎn)錄因子有待研究。有研究報道,Mybph基因在肌肉發(fā)育過程中差異性表達,而且會與其它轉(zhuǎn)錄因子共同作用調(diào)控肌肉發(fā)育。因此,為了驗證Mybph基因?qū)〖毎恼{(diào)控作用,我們檢測了豬不同組織中Mybph基因的相對表達情況;通過生物信息學(xué)對Mybph蛋白表達位置進行預(yù)測,并使用激光共聚焦技術(shù)進行驗證;檢測Mybph基因在C2C12細胞分化過程中的時空表達;構(gòu)建真核表達載體pcDNA3.1(+)-Mybph和合成Mybph基因的干涉片段,轉(zhuǎn)染C2C12細胞,通過實時無標記細胞分析技術(shù)(RTCA)、免疫熒光技術(shù)、western blot、流式細胞術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)等分析Mybph基因?qū)〖毎L的影響。主要研究結(jié)果如下:1.運用RT-PCR技術(shù)檢測了豬心、肝、脾、肺、腎、背肌、卵巢、子宮內(nèi)膜、垂體和下丘腦等10個組織中Mybph基因的表達量。結(jié)果顯示,Mybph基因在各組織都有表達,在背肌中表達量最高,在其余組織的相對表達量較低。2.利用生物信息學(xué)的方法對Mybph蛋白在細胞中的表達位置進行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)Mybph蛋白有98.5%的可能是在細胞質(zhì)表達,只有1.5%的可能性在細胞核表達。此外,通用激光共聚焦技術(shù)對Mybph蛋白在肌細胞中的表達位置進行了驗證,結(jié)果顯示,Mybph蛋白在細胞質(zhì)表達,與生物信息學(xué)預(yù)測相吻合。3.利用RT-PCR方法檢測Mybph基因在C2C12細胞分化過程中的時空表達情況,結(jié)果顯示,隨著細胞分化,相對表達量升高。4.利用RT-PCR技術(shù)檢測上調(diào)/下調(diào)Mybph基因?qū)〖毎只嚓P(guān)基因Myog、Myhc和Myomaker相對表達量的影響。結(jié)果顯示,上調(diào)Mybph基因使得肌細胞分化相關(guān)基因的相對表達量總體下降,下調(diào)Mybph基因使得肌細胞分化相關(guān)基因的相對表達量總體上升。5.運用實時無標記細胞分析技術(shù)檢測上調(diào)/下調(diào)Mybph基因?qū)2C12細胞增殖的影響,發(fā)現(xiàn)上調(diào)Mybph基因能夠抑制細胞數(shù)目的增殖,下調(diào)Mybph基因能夠促進細胞的增殖。6.使用免疫熒光技術(shù)和western blot技術(shù)在蛋白水平檢測上調(diào)/下調(diào)Mybph對細胞增殖標記蛋白Ki67表達量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),上調(diào)Mybph基因能夠抑制Ki67的表達,下調(diào)Mybph基因能夠促進Ki67的表達。7.運用流式細胞術(shù)檢測上調(diào)/下調(diào)Mybph基因?qū)2C12細胞周期的影響,結(jié)果顯示,Mybph參與了細胞周期的調(diào)節(jié),上調(diào)Mybph會使得更多細胞停留在G1期,下調(diào)Mybph會使得更多細胞停留在G2期和S期。
【關(guān)鍵詞】：骨骼肌 增殖 分化 細胞周期 Mybph 轉(zhuǎn)錄調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.2
【目錄】：

• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 縮略語表12-13
• 1 前言13-22
• 1.1 研究問題的由來13
• 1.2 骨骼肌生長發(fā)育調(diào)控相關(guān)研究13-18
• 1.2.1 骨骼肌發(fā)育的基本過程14-15
• 1.2.2 骨骼肌生長發(fā)育過程中主要調(diào)控因子研究進展15-17
• 1.2.3 骨骼肌的再生17-18
• 1.3 Mybph基因研究進展18-21
• 1.3.1 Mybph基因的結(jié)構(gòu)18-19
• 1.3.2 Mybph基因的功能研究進展19-21
• 1.4 研究目的與意義21-22
• 2 實驗材料與方法22-42
• 2.1 材料22-26
• 2.1.1 豬組織樣品22
• 2.1.2 細胞系、載體和菌株22-23
• 2.1.3 主要試劑與試劑盒23-24
• 2.1.4 主要試劑的配制24-25
• 2.1.5 主要儀器設(shè)備25-26
• 2.1.6 主要生物學(xué)分析軟件及網(wǎng)站26
• 2.2 試驗方法26-42
• 2.2.1 組織和細胞總RNA的提取26-27
• 2.2.2 cDNA的合成27-28
• 2.2.3 引物的設(shè)計28-29
• 2.2.4 PCR擴增反應(yīng)29
• 2.2.5 豬組織表達譜的構(gòu)建29-30
• 2.2.6 真核表達載體的構(gòu)建30-33
• 2.2.7 干涉片段的合成33
• 2.2.8 細胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染33-35
• 2.2.9 激光共聚焦技術(shù)35
• 2.2.10 細胞增殖實驗35-36
• 2.2.11 免疫熒光技術(shù)36-37
• 2.2.12 Western Blot技術(shù)37-40
• 2.2.13 細胞周期的測定40-42
• 3 結(jié)果與分析42-56
• 3.1 Mybph基因的組織表達譜42
• 3.2 生物信息學(xué)對小鼠Mybph蛋白亞細胞定位的預(yù)測42-43
• 3.3 Mybph在C2C12細胞中的表達定位43-44
• 3.4 真核表達載體pcDNA3.1(+)-Mybph的構(gòu)建44-46
• 3.4.1 C2C12細胞RNA的提取及cDNA的合成44-45
• 3.4.2 PMD-18T-Mybph質(zhì)粒與真核表達載體pcDNA3.1(+)的雙酶切45-46
• 3.5 干涉片段的選擇46
• 3.6 Mybph基因在C2C12細胞分化過程中的時空表達情況46-47
• 3.7 Mybph基因?qū)2C12細胞分化的影響47-50
• 3.7.1 超表達Mybph基因?qū)2C12細胞分化的影響47-48
• 3.7.2 干涉Mybph基因?qū)2C12細胞分化的影響48-50
• 3.8 Mybph基因?qū)2C12細胞增殖的影響50-54
• 3.8.1 實時無標記分析技術(shù)（RCTA）檢測Mybph基因?qū)2C12細胞增殖的影響50-51
• 3.8.2 免疫熒光技術(shù)檢測Mybph基因?qū)2C12細胞增殖影響51-54
• 3.8.3 Western blot檢測Mybph基因?qū)2C12細胞增殖影響54
• 3.9 Mypbh基因?qū)毎芷诘挠绊?/span>54-56
• 4 討論56-59
• 4.1 Mybph基因在成肌細胞時空分化過程中表達差異56
• 4.2 Mybph基因在豬不同組織的差異性表達56
• 4.3 Mybph基因?qū)Τ杉〖毎鲋�、分化的調(diào)控56-58
• 4.3.1 Mybph基因?qū)Τ杉〖毎只挠绊?/span>57
• 4.3.2 Mybph基因?qū)Τ杉〖毎鲋车挠绊?/span>57-58
• 總結(jié)58-59
• 5 小結(jié)59-61
• 5.1 本研究的主要結(jié)果59-60
• 5.2 本研究的創(chuàng)新點60
• 5.3 下一步工作計劃60-61
• 參考文獻61-69
• 致謝69

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本文編號：912559