本文關(guān)鍵詞：禽傳染性喉氣管炎病毒gJ蛋白的原核表達及單克隆抗體的研制與標(biāo)準(zhǔn)抗原抗體的制備

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【摘要】：傳染性喉氣管炎(Infectious Laryngotracheitis, ILT)是由皰疹病毒科傳染性喉氣管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis virus, ILTV)引起的雞的一種呼吸道傳染病。主要臨床癥狀為咳出含有血液的滲出物并伴發(fā)高死亡率,引起流鼻涕、結(jié)膜炎、體重和產(chǎn)蛋下降。本病自1925年首次報道以來,現(xiàn)已遍布各養(yǎng)禽國家和地區(qū),我國主要呈地方流行。本研究利用原核表達系統(tǒng)成功表達重組蛋白His-gJ,并研制了3株針對ILTV gJ蛋白的單克隆抗體。同時以ILTV王崗(WG)株免疫SPF雞制得多抗血清,對ILTV抗原和抗血清進行一系列標(biāo)定,獲得了ILTV的標(biāo)準(zhǔn)抗原和標(biāo)準(zhǔn)血清,為ILTV的診斷和防治提供了有效的方法和材料。1、抗禽傳染性喉氣管炎病毒酣蛋白原核表達與單克隆抗體的研制根據(jù)GenBank中已發(fā)表的傳染性喉氣管炎病毒gJ全基因序列設(shè)計gJ編碼區(qū)(445-745位氨基酸)的特異性引物,上下游引物分別引入酶切位點BamHI和Xho I,以傳染性喉氣管炎病毒W(wǎng)G株基因組為模板進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物克隆并連接到原核表達載體pET-32a(+)中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-gJ并轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,獲得大小為55KD的重組蛋白His-gJ。并利用親和柱對重組蛋白His-gJ進行純化,SDS-PAGE和Western-Blot結(jié)果表明,融合蛋白His-gJ具有良好的抗原性；利用獲得的ILTV重組蛋白His-gJ為抗原,建立檢測ILTV抗體的ELISA方法。以ILTV WG株全病毒作為免疫原,按照常規(guī)程序免疫6-8周齡Balb/c小鼠,取脾細胞與S/P20細胞融合,利用重組蛋白His-gJ進行間接酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)篩選陽性細胞株,最終得到3株分泌針對ILTV gJ蛋白單克隆抗體的陽性細胞株,分別命名為：ILTV-gJ-4C6、ILTV-gJ-5B8、ILTV-gJ-6B6。Western-Blot與間接免疫熒光(IFA)鑒定結(jié)果表明,所得三株單抗均能與ILTV WG株天然病毒發(fā)生特異性反應(yīng)。3株單克隆抗體的抗體亞類均為IgG1,Kappa鏈。利用親和層系技術(shù)分別純化了3株單抗腹水,獲得了高純度的單克隆抗體,為今后建立ILTV檢測技術(shù)提供了良好的試劑材料。2、禽傳染性喉氣管炎病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原及血清的制備本研究用SPF雞胚擴增禽傳染性喉氣管炎病毒W(wǎng)G株,對收集的傳染性喉氣管炎病毒進行了病毒含量測定分析,結(jié)果該材料中病毒為10-49ELD50/0.2mL。血凝試驗(HA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)及ELISA實驗技術(shù)進一步鑒定了該病毒無傳染性法氏囊病毒(IBDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、小鵝瘟病毒(GPV)、馬立克氏病病毒(MDV)、禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、雞產(chǎn)蛋下降綜合癥(EDS-76)、禽白血病病毒(ALV)等外源性病毒污染,無菌檢驗也證明該病毒材料無菌生長、無支原體污染。將該ILTV全病毒抗原經(jīng)一系列標(biāo)定,加入1%BSA凍存保護劑,分裝,凍干,并進行物理性狀和無菌檢驗及支原體污染檢驗,最后獲得了ILTV的標(biāo)準(zhǔn)抗原。將ILTV WG株多次免疫SPF雞,制得了抗ILTV多抗血清,用重組融合蛋白酣進行間接ELISA檢測,結(jié)果表明該血清的ELISA效價為1：1200。利用HI、IFA實驗技術(shù)鑒定該多抗血清抗體,證明該血清與上述其他病毒多抗血清無交叉反應(yīng)性,僅與ILTV反應(yīng),特異性良好；無菌檢驗、支原體檢驗合格。經(jīng)一系列標(biāo)定后,在血清中加入萬分之一的硫柳汞防腐劑,分裝,凍干,并進行物理性狀的檢查以及均一性、穩(wěn)定性、長期保存性的鑒定,最終獲得了高質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)血清。通過標(biāo)定陽性及弱陽性血清,對目前市場上常用的商品化檢測ILTV抗體的ELISA試劑盒可靠性進行了測定,證明所試兩種商品化ELISA試劑盒可用于臨床樣品檢測。
【關(guān)鍵詞】：傳染性喉氣管炎病毒 gJ蛋白 單克隆抗體 標(biāo)準(zhǔn)抗原 標(biāo)準(zhǔn)血清 ELISA
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-12
• 符號說明12-14
• 文獻綜述14-30
• 1 病原學(xué)14-21
• 1.1 病毒分類及基本結(jié)構(gòu)14-15
• 1.2 理化特性15
• 1.3 生物學(xué)特性15-16
• 1.4 病毒基因組結(jié)構(gòu)16-20
• 1.4.1 gB基因18
• 1.4.2 gC基因18
• 1.4.3 gD基因18-19
• 1.4.4 gG基因19
• 1.4.5 gJ基因19
• 1.4.6 TK基因19-20
• 1.4.7 其它基因20
• 1.5 病毒復(fù)制20-21
• 2 流行病學(xué)21
• 3 臨床癥狀及病理學(xué)變化21-22
• 4 診斷22-24
• 4.1 組織學(xué)檢查22
• 4.2 電鏡檢查22-23
• 4.3 病毒分離23
• 4.4 免疫熒光試驗23
• 4.5 瓊脂擴散試驗23
• 4.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)23-24
• 4.7 病毒中和試驗24
• 4.8 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)24
• 5 防制24-25
• 6 獸用生物制品國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究現(xiàn)狀25-30
• 6.1 OIE傳染性喉氣管炎病毒檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)25-26
• 6.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的作用26-27
• 6.3 我國獸用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)現(xiàn)狀27-30
• 研究內(nèi)容一 禽傳染性喉氣管炎病毒gJ蛋白表達與單克隆抗體的研制30-53
• 1 材料31
• 1.1 生物材料31
• 1.2 試劑與載體31
• 2 方法31-42
• 2.1 ILTV gJ蛋白的原核表達31-36
• 2.1.1 引物設(shè)計及目的片段的擴增31-32
• 2.1.2 目的片段的克隆32-33
• 2.1.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化33
• 2.1.4 陽性質(zhì)粒的提取及鑒定33
• 2.1.5 ILTV gJ基因原核表達載體的構(gòu)建33-34
• 2.1.6 重組蛋白His-gJ的誘導(dǎo)表達34-35
• 2.1.7 重組蛋白His-gJ蛋白的純化35
• 2.1.8 Western-blot鑒定重組蛋白His-gJ抗原性35-36
• 2.2 抗ILTV gJ單克隆抗體的制備36-40
• 2.2.1 動物免疫36
• 2.2.2 細胞融合的準(zhǔn)備36
• 2.2.3 飼養(yǎng)細胞的制備36-37
• 2.2.4 細胞融合37
• 2.2.5 陽性克隆篩選方法的建立37
• 2.2.6 陽性雜交瘤的篩選37-38
• 2.2.7 陽性雜交瘤的亞克隆及凍存38
• 2.2.8 單克隆抗體的特性鑒定38-39
• 2.2.9 腹水的制備及純化39-40
• 2.3 檢測ILTV抗體間接ELISA方法的初步建立40-42
• 2.3.1 間接ELISA的程序40-41
• 2.3.2 最適抗原包被量與抗體工作濃度的優(yōu)化41
• 2.3.3 最適反應(yīng)時間的確定41
• 2.3.4 最適顯色時間的確定41-42
• 2.3.5 臨界值的確定42
• 3 結(jié)果42-51
• 3.1 gJ蛋白的表達42-45
• 3.1.1 ILTV WG株gJ基因擴增結(jié)果42-43
• 3.1.2 pET-32a-gJ原核表達載體的構(gòu)建43-44
• 3.1.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達44
• 3.1.4 重組蛋白的純化及抗原性鑒定44-45
• 3.2 抗ILTV gJ單克隆抗體的制備45-49
• 3.2.1 陽性雜交瘤細胞株的篩選45-46
• 3.2.2 單克隆抗體亞型鑒定46
• 3.2.3 單克隆抗體與全病毒反應(yīng)性46-47
• 3.2.4 IFA證實單抗能識別細胞感染中的病毒抗原47-48
• 3.2.5 抗體純化效果48-49
• 3.3 檢測ILTV抗體間接ELISA方法的初步建立49-51
• 3.3.1 最適抗原包被量與抗體工作濃度49-50
• 3.3.2 最適反應(yīng)時間的確定50-51
• 3.3.3 最適顯色時間的確定51
• 3.3.4 臨界值的確定51
• 4 小結(jié)和討論51-53
• 研究內(nèi)容二 禽傳染性喉氣管炎病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原及抗體的制備53-73
• 1 材料54
• 1.1 生物材料54
• 1.2 主要儀器和試劑54
• 2 方法54-62
• 2.1 ILTV標(biāo)準(zhǔn)抗原的制備54-55
• 2.1.1 病毒擴增54-55
• 2.1.2 病毒基因組的提取55
• 2.2 ILTV多抗血清的制備55
• 2.3 禽傳染性喉氣管炎病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)定55-62
• 2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)抗原的純粹性鑒定55-57
• 2.3.2 病毒抗原中病毒ELD50含量的測定57
• 2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)血清的ELISA反應(yīng)性的測定57-58
• 2.3.4 ILTV多抗血清特異性鑒定58
• 2.3.5 陽性及弱陽性血清的確定58
• 2.3.6 標(biāo)準(zhǔn)抗原及血清的分裝58-59
• 2.3.7 物理性狀的檢查59
• 2.3.8 無菌檢驗59
• 2.3.9 支原體檢驗59-60
• 2.3.10 血清效價測定60
• 2.3.11 血清均一性檢驗60
• 2.3.12 血清穩(wěn)定性檢驗60
• 2.3.13 血清長期保存性測定60
• 2.3.14 ILTV標(biāo)準(zhǔn)抗體用于商品化ELISA試劑盒的檢驗60-62
• 3 結(jié)果62-71
• 3.1 ILTV標(biāo)準(zhǔn)抗原的制備62
• 3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)抗原中ICP4基因62
• 3.2 禽傳染性喉氣管炎病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)定62-71
• 3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)抗原的純粹性鑒定結(jié)果62-63
• 3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)抗原中病毒ELD50含量63-64
• 3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)血清的ELISA反應(yīng)性64-65
• 3.2.4 標(biāo)準(zhǔn)血清抗體的特異性65-67
• 3.2.5 陽性及弱陽性血清的確定67
• 3.2.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的分裝67
• 3.2.7 物理性狀的檢查67
• 3.2.8 無菌檢驗67-68
• 3.2.9 支原體檢驗68
• 3.2.10 凍干和防腐劑處理對標(biāo)準(zhǔn)抗體效價的影響68-69
• 3.2.11 均一性69
• 3.2.12 穩(wěn)定性69
• 3.2.13 長期保存69-70
• 3.2.14 ILTV標(biāo)準(zhǔn)抗體對商品化ELISA試劑盒檢驗結(jié)果70-71
• 4 小結(jié)和討論71-73
• 全文總結(jié)73-74
• 參考文獻74-83
• 致謝83-84

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本文編號：907427