發(fā)布時間：2017-09-23 05:17

  本文關鍵詞：我國東北三省蝙蝠病毒組學及其新病毒的鑒定

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【摘要】：蝙蝠是世界上僅次于嚙齒類動物的種類最為豐富的哺乳動物,分布在除兩極的所有陸地。同時,蝙蝠又是重要的病毒儲存庫,能攜帶至少170種病毒,包括一些人獸共患病毒,如狂犬病毒、亨德拉病毒、埃博拉病毒、博卡病毒等。在我國有120種蝙蝠,分屬于12個蝙蝠科30個蝙蝠屬,廣泛分布在我國的多個地區(qū)。東北三省包括遼寧、吉林和黑龍江,與俄羅斯和朝鮮接壤,具有重要的戰(zhàn)略地位;該地區(qū)地域遼闊,氣候獨特,蝙蝠資源目前沒有系統(tǒng)的數據,而關于我國東北地區(qū)蝙蝠攜帶病毒的數據更是嚴重缺乏,僅發(fā)現了蝙蝠伊庫特病毒(Irkut virus,狂犬病毒屬成員)、博卡病毒和冠狀病毒,因而系統(tǒng)全面調查我國東北三省蝙蝠攜帶病毒的多樣性和遺傳多態(tài)性,對于了解東北地區(qū)蝙蝠病毒的本地情況具有重要的意義。本研究在2013-2014年間,于東北三省實地考察了16個市的蝙蝠生態(tài)情況,結果在6個市發(fā)現了蝙蝠,其種類主要是馬鐵菊頭蝠、大足鼠耳蝠、白腹管鼻蝠和東方蝙蝠等,我們在這些市設置了10個蝙蝠病毒監(jiān)測點,共采集了204只蝙蝠樣本。通過本實驗室已建立的病毒宏基因組學方法對以上樣本進行病毒組分析,發(fā)現了22個科的病毒,其中注釋到脊椎動物病毒有16個科20個屬32個種,如白蛉熱病毒、α冠狀病毒和β冠狀病毒、人副流感病毒4型、星狀病毒以及博卡病毒等;昆蟲病毒6個科,如Baculoviridae、Dicistroviridae、Iflaviridae、Parvoviridae(Ambidensovirus)、Polydnaviridae和Tetraviridaes等;還發(fā)現一個植物病毒科,Phycodnaviridae。本研究主要關注脊椎動物病毒,根據病毒宏基因組學分析結果,對星狀病毒、水泡性病毒、細小病毒、小RNA病毒、環(huán)狀病毒、布尼亞病毒、圓環(huán)病毒、冠狀病毒等進行了鑒定分析。從遼寧省本溪市的馬鐵菊頭蝠和大足鼠耳蝠中,有病毒序列注釋到了星狀病毒科,在這些星狀病毒序列中,與不丹國人星狀病毒BtnMLB1-86同源性最高,為84%。彈狀病毒科中的水皰性病毒序列發(fā)現于遼寧本溪市的馬鐵菊頭蝠和大足鼠耳蝠中,其中水皰性病毒與美國蝙蝠水皰性病毒TFFN-2013株同源性最高,為64.3%。使用特異性PCR篩查,從遼寧省本溪市溪湖區(qū)6只馬鐵菊頭蝠中檢測到2只蝙蝠攜帶水泡性病毒,陽性率為33.3%;從遼寧省本溪市本溪縣4只馬鐵菊頭蝠中檢測到1只蝙蝠攜帶水泡性病毒,陽性率為25.0%;從遼寧省本溪市恒仁縣2只馬鐵菊頭蝠中全部檢測到水泡性病毒,陽性率為100%。小RNA病毒科的心病毒序列發(fā)現于吉林省的馬鐵菊頭蝠和大足鼠耳蝠中,其中心病毒序列與剛果蝙蝠環(huán)狀病毒PREDICT-06105同源性最高,為84%;并在吉林省通化市的28只大足鼠耳蝠中,檢測出9只蝙蝠攜帶有心病毒,陽性率為33.3%。病毒宏基因組學結果中,注釋到了細小病毒科博卡細小病毒屬和依賴細小病毒屬,在吉林省通化市的29只馬鐵菊頭蝠中,檢測出19只蝙蝠攜帶博卡病毒,陽性率為65.5%;在遼寧省本溪市的馬鐵菊頭蝠和大足鼠耳蝠、吉林省通化市的白腹管鼻蝠以及黑龍江省的東方蝙蝠中,均發(fā)現有病毒序列注釋到細小病毒科依賴細小病毒屬,這三株細小病毒均與我國蝙蝠腺聯病毒ynm株有最高同源,分別為84%、89%以及87%,并且它們均與依賴細小病毒屬病毒處在同一進化分支。注釋到了呼腸孤病毒科的環(huán)狀病毒的病毒序列,來源于于遼寧省本溪市的馬鐵菊頭蝠和大足鼠耳蝠中,與澳大利亞環(huán)狀病毒屬的eubenangeevirus具有最高同源性,為79%,并在遼寧省本溪市的29只大足鼠耳蝠中,檢測出4只蝙蝠攜帶有環(huán)狀病毒,陽性率為13.8%。。同時,這株蝙蝠環(huán)狀病毒是國內首次從蝙蝠中檢測到的。另外,通過特異性pcr驗證,從黑龍江省的蝙蝠中,檢測到了兩株圓環(huán)病毒,一株是在哈爾濱市阿城區(qū)的43只東方蝙蝠中,檢測出2只蝙蝠有圓環(huán)病毒基因存在,陽性率為4.7%;另外一株是在大慶市薩爾圖區(qū)的9只東方蝙蝠中檢測到1只蝙蝠攜帶圓環(huán)病毒,陽性率為11.1%。在吉林省通化市的40只白腹管鼻蝠中,檢測出2只蝙蝠含有腮腺炎病毒屬(rubulavirus)病毒基因,陽性率為5%。從吉林省通化市的29只馬鐵菊頭蝠中,檢測到有8只馬鐵菊頭蝠攜帶有布尼亞病毒基因,陽性率為27.6%。對于冠狀病毒的檢測,一株是從吉林省通化市的40只白腹管鼻蝠中檢測出一只蝙蝠攜帶α冠狀病毒屬的冠狀病毒基因,陽性率為2.5%,另外一株是從吉林省通化市的29只馬鐵菊頭蝠檢測出一只蝙蝠攜帶有β冠狀病毒屬的冠狀病毒基因,陽性率為3.5%。針對以上鑒定結果,挑取了圓環(huán)病毒、布尼亞病毒、副粘病毒和冠狀病毒進行了更進一步的研究。對兩株圓環(huán)病毒進行全基因組學分析,獲得了長2117nt和2113nt基因組序列。對基因組預測分析,在復制原點處,均存在莖環(huán)結構;還都存在poly(t)結構。系統(tǒng)進化分析,蝙蝠圓環(huán)病毒的全基因組序列與圓環(huán)病毒屬vs7100003株狐貍圓環(huán)病毒存在最高同源性,通過系統(tǒng)進化分析,發(fā)現也與這株狐貍圓環(huán)病毒處在同一進化分支,均為圓環(huán)病毒屬成員,這是東北三省首次發(fā)現蝙蝠圓環(huán)病毒。對白蛉熱病毒屬的這株布尼亞病毒進行分析,發(fā)現與我國陜西rp-bunyav/shaanxi2011株蝙蝠布尼亞病毒存在最高同源,并且同處同一進化分支,與白蛉熱病毒屬病毒近緣,這是東北三省首次發(fā)現蝙蝠布尼亞病毒。獲得了5318nt長的蝙蝠副粘病毒基因序列,分析發(fā)現與人副流感病毒4型具有最高的同源性,并且均處在同一進化分支,均為腮腺炎病毒屬病毒,這是東北三省首次發(fā)現蝙蝠副流感病毒。在吉林省通化市,獲得了jtac2株α冠狀病毒和jtmc15株β冠狀病毒兩株冠狀病毒,基因分析發(fā)現jtac2株α冠狀病毒與我國Neixiang14株冠狀病毒具有最高同源性,同時也處在α冠狀病毒屬內的同一進化分支中;JTMC15株β冠狀病毒與Rf1株SARS樣冠狀病毒具有最高的同源性,均處β冠狀病毒屬β2群中,均為β冠狀病毒屬病毒,同時,也發(fā)現JTMC15株β冠狀病毒存在整個基因8缺失的現象。本研究使用病毒宏基因學方法首次對東北三省的蝙蝠病毒組全面調查,獲得了大量的蝙蝠病毒組信息;鑒定了13種脊椎動物病毒,其中包括星狀病毒、細小病毒、小RNA病毒、水泡性病毒、環(huán)狀病毒、圓環(huán)病毒、布尼亞病毒、副粘病毒以及冠狀病毒等,并對其中圓環(huán)病毒、布尼亞病毒、副粘病毒以及冠狀病毒進行了進一步分析,獲得了圓環(huán)病毒和兩株冠狀病毒全基因組序列。而在這些病毒種,有很多病毒為首次在東北三省發(fā)現,比如星狀病毒、水泡性病毒、細小病毒、小RNA病毒、布尼亞病毒、圓環(huán)病毒、α冠狀病毒等。另外,依據病毒宏基因組病毒序列及其注釋信息,也能夠找出這些病毒序列對應的蝙蝠樣品信息,大大提高了對蝙蝠攜帶病毒信息的發(fā)掘效率,體現出了病毒宏基因組學分析的優(yōu)勢性,這也說明病毒宏基因組學分析手段在發(fā)現新型病毒的工作中,能夠起到突破性的作用。同時也發(fā)現了東北三省蝙蝠攜帶大量的蝙蝠源病毒,獲得了東北三省蝙蝠攜帶病毒的本底數據,也進一步豐富了蝙蝠病毒的數據庫,了解了蝙蝠病毒的多樣性,系統(tǒng)獲得了東北三省蝙蝠攜帶病毒組的情況。同時,也獲得了東北三省蝙蝠棲息環(huán)境情況,為以后了解蝙蝠棲息環(huán)境提供了基礎數據。
【關鍵詞】：東北三省 蝙蝠病毒 病毒宏基因組學分析 病毒鑒定
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 縮略詞7-9
• 倫理證明9-10
• 摘要10-13
• Abstract13-17
• 前言17-19
• 第一章 東北三省蝙蝠病毒宏基因組學研究19-49
• 1.1 材料19-23
• 1.1.1 蝙蝠樣本19-22
• 1.1.2 主要試劑及耗材22
• 1.1.3 實驗儀器22
• 1.1.4 生物信息學軟件22-23
• 1.2 方法23-27
• 1.2.1 蝙蝠種類鑒定23-24
• 1.2.2 病毒宏基因組學處理24
• 1.2.3 病毒宏基因組學測序24
• 1.2.4 病毒驗證24-27
• 1.3 結果27-43
• 1.3.1 蝙蝠種類鑒定及樣品采集信息27
• 1.3.2 病毒宏基因組學分析結果27-30
• 1.3.3 病毒序列分析及檢測結果30-43
• 1.4 討論43-49
• 第二章 新型蝙蝠病毒的鑒定49-79
• 2.1 材料49-50
• 2.1.1 蝙蝠樣品49
• 2.1.2 試劑及耗材49
• 2.1.3 細胞系49-50
• 2.1.4 實驗儀器50
• 2.1.5 生物信息學軟件50
• 2.2 方法50-58
• 2.2.1 病毒核酸提取50
• 2.2.2 引物設計50-51
• 2.2.3 蝙蝠樣品檢測51
• 2.2.4 病毒全基因組擴增及測序51-58
• 2.2.5 病毒分離58
• 2.3 結果58-74
• 2.3.1 蝙蝠圓環(huán)病毒鑒定結果58-65
• 2.3.2 蝙蝠布尼亞病毒鑒定結果65-68
• 2.3.3 蝙蝠副粘病毒鑒定結果68-71
• 2.3.4 蝙蝠冠狀病毒鑒定結果71-74
• 2.4 討論74-79
• 結論79-81
• 參考文獻81-91
• 附錄91-97
• 個人簡介97-99
• 致謝99-101

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