發(fā)布時間：2017-09-16 12:06

  本文關鍵詞：布魯氏菌16M經(jīng)ROS通路介導AIR抑制細胞自噬調(diào)控炎性小體的機制研究

  更多相關文章： 布魯氏菌 AIR ROS 自噬 凋亡 炎癥

【摘要】：布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一類自然疫源性人獸共患病,在世界范圍內(nèi)廣泛流行,尤其是發(fā)展中國家,近幾年回升勢頭迅猛。布魯氏菌主要毒力表現(xiàn)在能侵入宿主細胞并在其中生存增殖形成持續(xù)性感染的能力。自噬與布魯氏菌胞內(nèi)寄生機制密切相關,目前,有研究表明膜融合相關蛋白TECPR1的結(jié)構域AIR在自噬發(fā)生過程中起著重要作用,但在布魯氏菌誘導的自噬過程中該蛋白的作用機制尚未明確。活性氧(ROS)在自噬、炎癥以及凋亡的發(fā)生過程中都起著重要作用。布魯氏菌侵染巨噬細胞后能夠引發(fā)巨噬細胞自噬、炎癥以及凋亡,但是其具體的影響機制、是否與ROS通路有關目前尚未明確。本研究全面探索布魯氏菌感染引發(fā)的炎癥、自噬以及凋亡反應是否與AIR結(jié)構域、ROS通路有關,為藥物和疫苗的研發(fā)奠定一定的理論基礎。目的:本研究分別構建AIR結(jié)構域沉默(I-A)、過表達(O-A)、干擾后回補(OA-IA)的穩(wěn)定細胞株,并建立羊種布魯氏菌標準株16M(16M)侵染巨噬細胞模型,研究16M侵染巨噬細胞后:(1)巨噬細胞炎癥、自噬以及凋亡的發(fā)生是否通過ROS這一通路,及ROS在巨噬細胞發(fā)生炎癥、自噬以及凋亡過程中所起的作用;(2)AIR結(jié)構域?qū)奘杉毎l(fā)生炎癥、自噬與凋亡時所起的作用;(3)AIR結(jié)構域與ROS相互作用的關系。進一步揭示布魯氏菌在巨噬細胞內(nèi)持續(xù)性感染的分子機制,為藥物和疫苗研發(fā)、疾病防控、家畜抗病育種等奠定理論基礎。方法:通過慢病毒包裝的方法,對AIR基因進行沉默(I-A)、過表達(O-A)、干擾后回補(OA-IA)后構建穩(wěn)定的細胞系,并建立16M侵染細胞模型。在未處理組和NAC(ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)預處理組中的不同時間(0、3、6、12和24 h)段,采用激光共聚焦顯微鏡和透射電子顯微鏡、多功能酶標儀、熒光定量PCR、ELISA及Western blot等方法檢測與細胞炎癥、自噬以及凋亡相關蛋白表達水平,ROS的產(chǎn)生水平以及線粒體的分布情況。結(jié)果:⑴成功構建AIR干擾、過表達載體,并獲得AIR干擾、過表達及回復的穩(wěn)定細胞系;⑵16M能以時間依賴性方式誘導RAW264.7細胞產(chǎn)生ROS,干擾AIR后有利于ROS的產(chǎn)生。I-A組和O-A組線粒體發(fā)生異常集聚。16M侵染細胞6 h后,實驗組中炎性小體相關蛋白ASC、Caspase-1、NLRP3、AIM2的表達量均顯著下降。ELISA檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,I-A組在侵染12 h時可導致炎性因子IL-18高表達(P0.05);O-A組在侵染6、12 h時可導致炎性因子IL-1β高表達,且差異顯著。NAC預處理的實驗組中ROS的產(chǎn)生顯著降低;I-A組中,NLRP3/AIM2炎癥復合體相關成份和炎性因子的表達顯著升高;⑶自噬結(jié)果:激光共聚焦結(jié)果顯示16M侵染后細胞內(nèi)出現(xiàn)了GFP-LC3點狀聚集。與對照組相比,I-A組、O-A組和OA-IA組中線粒體出現(xiàn)異常集聚。q RT-PCR結(jié)果顯示,與對照組相比,I-A組中LC3B/A在16M侵染6 h時表達量最高;I-A組和O-A組中16M侵染6 h時p62的表達被顯著抑制。NAC預處理后,I-A組中LC3B/A顯著升高;I-A組中p62在16M侵染6 h時表達顯著性升高。Western blot檢測結(jié)果:16M侵染6 h時,I-A組中p62蛋白表達量顯著低于對照組。NAC預處理后,I-A組中p62蛋白表達量顯著高于對照組。⑷流式細胞儀檢測顯示16M侵染后細胞凋亡率顯著升高,細胞凋亡率與侵染時間呈正相關。NAC預處理后,細胞凋亡率顯著下降。與對照組相比,16M侵染6 h后,FITC/PI染色后綠染和紅染的細胞增多;NAC預處理后,綠染和紅染細胞數(shù)均顯著減少,且凋亡細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變。16M侵染6 h后,16M能夠刺激Bax/Bcl-2顯著性的高表達;NAC預處理后,16M侵染6 h后各實驗組中Bax/Bcl-2的表達均顯著降低。Western blot顯示Caspase-3在蛋白水平上表達顯著升高;NAC預處理后,Caspase-3在蛋白水平上表達顯著降低。結(jié)論:⑴干擾和過表達AIR后,ROS釋放量發(fā)生顯著變化,且線粒體出現(xiàn)異常集聚。AIR與炎性小體的活化、炎癥的發(fā)生密切相關。16M通過ROS途徑激活NLRP3/AIM2炎癥復合體誘導RAW264.7細胞分泌IL-1β和IL-18;⑵干擾AIR后,細胞內(nèi)線粒體出現(xiàn)異常集聚,引起自噬相關基因表達量發(fā)生改變,提高了細胞自噬活性。NAC預處理細胞后,在16M侵染6 h時,I-A組抑制了細胞自噬的活性;NAC通過抑制ROS的產(chǎn)生從而抑制了細胞自噬的發(fā)生;⑶16M能夠通過ROS途徑誘導細胞發(fā)生凋亡;⑷16M侵染后,ROS可引起細胞發(fā)生凋亡、炎癥和自噬。AIR可以抑制自噬小體成熟和自噬的發(fā)生。自噬負調(diào)控炎癥小體激活,并抑制炎癥反應的發(fā)生;線粒體自噬可促進細胞的凋亡。
【關鍵詞】：布魯氏菌 AIR ROS 自噬 凋亡 炎癥
【學位授予單位】：石河子大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-12
• 縮略語12-14
• 引言14-16
• 第一章 文獻綜述 布魯氏菌致病的分子機制研究16-25
• 1 布魯氏菌的胞內(nèi)生存機制16-18
• 1.1 布魯氏菌對宿主細胞的侵入過程16-17
• 1.2 布魯氏菌在胞內(nèi)的生存與運輸17
• 1.3 布魯氏菌在胞內(nèi)的復制17-18
• 2 布魯氏菌與炎癥反應18-20
• 2.1 炎性小體18-19
• 2.2 線粒體與炎性小體19-20
• 2.3 炎性小體與布魯氏菌感染20
• 3 布魯氏菌與自噬反應20-22
• 3.1 細胞自噬的機制20-21
• 3.2 線粒體調(diào)控細胞自噬21-22
• 3.3“分子剎車”p62蛋白可抑制炎癥的發(fā)生22
• 3.4 細胞自噬與布魯氏菌感染22
• 4 布魯氏菌與凋亡反應22-25
• 4.1 細胞自噬與凋亡22-23
• 4.2 細胞凋亡機制23
• 4.3 線粒體調(diào)控細胞凋亡23-24
• 4.4 細胞凋亡與布魯氏菌感染24-25
• 第二章 實驗研究25-103
• 實驗一 AIR干擾、過表達和回復細胞系的構建與鑒定25-42
• 1 材料與方法25-36
• 1.1 材料25-26
• 1.2 方法26-36
• 2 結(jié)果36-40
• 2.1 目的基因AIR的擴增與重組質(zhì)粒的構建36-37
• 2.2 細胞支原體檢測37
• 2.3 熒光顯微鏡觀察慢病毒包裝和感染效果37-38
• 2.4 檢測AIR基因在不同處理組細胞中的表達量38-40
• 3 討論40-41
• 3.1 慢病毒載體的優(yōu)勢及對本實驗的影響40-41
• 3.2 慢病毒載體在疾病的預防和治療中的作用41
• 4 小結(jié)41-42
• 實驗二 初步探究AIR對布魯氏菌感染引發(fā)炎癥反應的影響42-70
• 1 材料與方法43-52
• 1.1 材料43
• 1.2 方法43-52
• 2 結(jié)果52-68
• 2.1 布魯氏菌的鑒定52
• 2.2 16M侵染對各組細胞ROS產(chǎn)生水平的影響52-54
• 2.3 MIito-ID? Red檢測 16M侵染后線粒體的分布54-56
• 2.4 電子顯微鏡觀察線粒體分布情況56-57
• 2.5 炎性相關基因Caspase-1、NLRP3、AIM2和ASC在基因水平的表達57-64
• 2.6 ELISA檢測 16M侵染后IL-1β、IL-18和Caspase-1 的表達量64-66
• 2.7 NLRP3、Caspase-1 p10在蛋白水平上的表達66-68
• 3 討論68-69
• 3.1 固有免疫與布魯氏菌68
• 3.2 固有免疫與ROS68-69
• 4 小結(jié)69-70
• 實驗三 初步探究AIR對由布魯氏菌感染引發(fā)的自噬的影響70-88
• 1 材料與方法70-73
• 1.1 材料70-71
• 1.2 方法71-73
• 2 結(jié)果73-86
• 2.1 RAW264.7-LC3細胞系的驗證73-74
• 2.2 激光共聚焦顯微鏡檢測LC3與線粒體共定位74-78
• 2.3 透射電子顯微鏡觀察自噬小體的形成78-79
• 2.4 qRT-PCR在mRNA水平檢測自噬相關因子的表達量79-86
• 2.5 Western blot檢測p62蛋白的表達水平86
• 3 討論86-87
• 3.1 細胞自噬與布魯氏菌感染86
• 3.2 ROS與自噬86-87
• 4 小結(jié)87-88
• 實驗四 初步探究AIR對布魯氏菌感染引發(fā)凋亡的影響88-103
• 1 材料與方法88-91
• 1.1 材料88-89
• 1.2 方法89-91
• 2 結(jié)果91-101
• 2.1 凋亡相關基因Bcl-2 和Bax在mRNA水平上的表達情況91-96
• 2.2 激光共聚焦顯微鏡檢測各組細胞凋亡96
• 2.3 透射電子顯微鏡檢測各組細胞的凋亡96-97
• 2.4 流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率97-100
• 2.5 Western blot檢測 16M侵染對Caspase-3 蛋白表達量的影響100-101
• 3 討論101-102
• 3.1 布魯氏菌與凋亡101
• 3.2 Bcl-2、ROS與自噬101-102
• 4 小結(jié)102-103
• 全文總結(jié)103-104
• 創(chuàng)新點104-105
• 參考文獻105-111
• 致謝111-112
• 作者簡介112-113
• 石河子大學碩士研究生學位論文導師評閱表113

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本文編號：862938