本文關(guān)鍵詞：牦牛Ghrelin對(duì)其極端生境適應(yīng)的分子機(jī)理

  更多相關(guān)文章： 青藏高原 牦牛 能量代謝 神經(jīng)調(diào)控 饑餓素

【摘要】：牦牛是適應(yīng)青藏高原高寒、低氧、枯草期慢長(zhǎng)等極端自然環(huán)境而生存、繁衍和生產(chǎn)的大型哺乳動(dòng)物之一。饑餓素(Ghrelin)是生長(zhǎng)激素促分泌素受體的唯一內(nèi)源性配體,也是唯一可以在外周刺激食欲的激素,其在“下丘腦—垂體—消化道”能量代謝系統(tǒng)中,作為“脂質(zhì)傳感器”,通過(guò)“神經(jīng)元突觸、迷走神經(jīng)和血液循環(huán)”傳導(dǎo),參與著機(jī)體食欲、體重、腸胃功能、脂肪、葡萄糖及脂類(lèi)代謝等多項(xiàng)任務(wù)的調(diào)節(jié),最終在下丘腦協(xié)同調(diào)控機(jī)體的能量代謝。因此,為了探討青藏高原動(dòng)物對(duì)其極端生態(tài)環(huán)境適應(yīng)的遺傳機(jī)制,本論文以牦牛為研究對(duì)象,以低海拔黃牛為對(duì)照,以Ghrelin為靶點(diǎn),通過(guò)基因克隆技術(shù)與序列比對(duì)分析、mRNA水平定量分析、蛋白定位及定量分析,并結(jié)合文獻(xiàn)挖掘和生物信息學(xué)研究方法構(gòu)建牦牛Ghrelin參與能量代謝的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型,系統(tǒng)探討了青藏高原牦牛Ghrelin對(duì)其極端生境適應(yīng)的分子機(jī)理。結(jié)果1.本論文初步克隆了牦牛下丘腦Ghrelin基因CDS的全長(zhǎng)序列,該序列僅含有一個(gè)351bp的開(kāi)放閱讀框,其編碼117個(gè)氨基酸;牦牛Ghrelin基因CDS全長(zhǎng)序列編碼的氨基酸序列與黃牛、綿羊、山羊和藏羚羊的同源性極高,分別為100%、91.38%、92.24%和92.24%;而與馬、驢、人、大鼠和小鼠的同源性較低,其分別為67.52%、68.38%、69.83%、70.09%和68.97%,且該氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化情況與其親緣關(guān)系遠(yuǎn)近一致。2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明,牦牛和黃牛的下丘腦、垂體、皺胃和十二指腸中均有Ghrelin mRNA的表達(dá),但表達(dá)趨勢(shì)不盡相同,其中牦牛皺胃和下丘腦Ghrelin mRNA的表達(dá)水平均極顯著地低于黃牛的(p0.001),分別為黃牛的0.5倍和0.7倍;而牦牛十二指腸和垂體Ghrelin mRNA的表達(dá)水平卻均極顯著地高于黃牛(p0.001),分別為黃牛的8倍(p0.001)和2倍。3.免疫組化結(jié)果表明,牦牛十二指腸、空腸、回腸和盲腸中均有Ghrelin免疫陽(yáng)性產(chǎn)物的分布,大量陽(yáng)性產(chǎn)物主要分布于小腸腺分泌細(xì)胞,而在小腸腺腺泡基底膜上僅有少量分布;然而,在對(duì)照組黃牛中該陽(yáng)性產(chǎn)物主要表達(dá)于黏膜層小腸腺腺泡基底膜。此外,免疫熒光結(jié)果表明,十二指腸Ghrelin蛋白的紅色熒光標(biāo)記物分布特征與免疫組化的相一致。4.ELISA分析結(jié)果表明,在牦牛和黃牛下丘腦、垂體、皺胃和十二指腸中Ghrelin蛋白總表達(dá)量(Total levels,TL)的表達(dá)趨勢(shì)一致,即TL皺胃TL十二指腸TL垂體TL下丘腦;但牦牛上述各組織Ghrelin蛋白的表達(dá)水平均極顯著地高于黃牛的(p0.001)。5.在牦牛Ghrelin參與能量代謝的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型中,Ghrelin通過(guò)與其受體GHSR直接或間接互作協(xié)同參與機(jī)體能量代謝調(diào)控的基因有NPY、AgRP、GOAT、Insulin、GHRH、Leptin、Motilin、Orexin、OX1R、OX2R、GH、MC4R、POMC、CCK和PYY共計(jì)16個(gè)。6.成功構(gòu)建了牦牛Ghrelin CDS編碼序列的真核熒光表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Ghrelin。結(jié)論1.在反芻動(dòng)物的進(jìn)化中,Ghrelin的氨基酸序列具有極高的保守性,其與生境特征沒(méi)有必然的聯(lián)系。2.與低海拔黃牛相比,牦牛在高寒、低氧、枯草期漫長(zhǎng)等極端高原生境適應(yīng)的能量代謝調(diào)控中,“下丘腦-垂體-消化道”軸高表達(dá)的Ghrelin蛋白,可能通過(guò)提高食欲促進(jìn)進(jìn)食、增加脂肪積累、調(diào)控體溫、降低能量消耗,而適應(yīng)其極端生境。3.在牦牛Ghrelin參與能量代謝的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型中,與Ghrelin通過(guò)其受體GHSR相互綁定直接互作協(xié)同參與機(jī)體能量代謝調(diào)控的基因有NPY、AgRP、GOAT、Insulin、GHRH和Leptin 6個(gè),其中前5個(gè)參與能量平衡的正調(diào)控,Leptin參與能量平衡的負(fù)調(diào)控;與Ghrelin間接互作協(xié)同參與機(jī)體能量代謝調(diào)控的基因有Motilin、Orexin、OX1R、OX2R、GH、MC4R、POMC、CCK、CCKAR、CCKBR和PYY共計(jì)11個(gè),其中前5個(gè)參與能量平衡的正調(diào)控,后6個(gè)參與能量平衡的負(fù)調(diào)控。其為進(jìn)一步系統(tǒng)探討青藏高原草食動(dòng)物尤其牦牛適應(yīng)其極端生境Ghrelin參與能量代謝的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：青藏高原 牦牛 能量代謝 神經(jīng)調(diào)控 饑餓素
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S823.85
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-11
• 第一章 文獻(xiàn)綜述11-24
• 1.1 牦牛及其能量代謝特征11-12
• 1.1.1 牦牛11
• 1.1.2 青藏高原生境特征11
• 1.1.3 青藏高原動(dòng)物/牦牛能量代謝特征11-12
• 1.2 能量代謝與神經(jīng)調(diào)控12-15
• 1.2.1 下丘腦12-15
• 1.2.2 腺垂體15
• 1.3 Ghrelin15-23
• 1.3.1 Ghrelin的結(jié)構(gòu)組成及其加工15-18
• 1.3.2 Ghrelin的定位18-19
• 1.3.3 Ghrelin的�；�19-20
• 1.3.4 Ghrelin的功能20-23
• 1.4 小結(jié)23-24
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法24-36
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料24-27
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物24
• 2.1.2 載體與菌株24
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)主要試劑24-25
• 2.1.4 溶液配制25-26
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)儀器26-27
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法27-36
• 2.2.1 牦牛Ghrelin基因CDS序列的克隆27-29
• 2.2.1.1 腦牛下丘腦總RNA的提取27-29
• 2.2.2 Real-Time Quantitative PCR29-31
• 2.2.3 石蠟切片及免疫組織化學(xué)染色31-33
• 2.2.4 免疫熒光化學(xué)染色33
• 2.2.5 ELISA33
• 2.2.6 牦牛下丘腦能量代謝相關(guān)因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建33
• 2.2.7 牦牛Ghrelin基因高效真核表達(dá)載體構(gòu)建33-36
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-49
• 3.1 牦牛Ghrelin基因CDS序列的克隆36-39
• 3.1.1 牦牛總RNA提取及凝膠電泳分析36
• 3.1.2 牦牛Ghrelin基因的PCR擴(kuò)增36-37
• 3.1.3 牦牛Ghrelin基因克隆及重組子鑒定37
• 3.1.4 牦牛Ghrelin氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析37-39
• 3.2 牦牛Ghrelin基因mRNA水平的表達(dá)研究39-40
• 3.3 牦牛Ghrelin蛋白在小腸及大腸的免疫組織化學(xué)定位40-44
• 3.3.1 Ghrelin在牦牛十二指腸中的定位41-42
• 3.3.2 Ghrelin在牦�？漳c中的定位42
• 3.3.3 Ghrelin在牦�；啬c中的定位42-43
• 3.3.4 Ghrelin在牦牛盲腸中的定位43-44
• 3.4 牦牛Ghrelin的蛋白定量研究44
• 3.5 牦牛下丘腦Ghrelin參與能量代謝的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型44-47
• 3.5.1 Ghrelin44-45
• 3.5.2 NPY45-46
• 3.5.3 瘦素（Leptin）46
• 3.5.4 膽囊收縮素（CCK）46-47
• 3.5.5 食欲素（Orexin）47
• 3.6 牦牛Ghrelin基因高效真核表達(dá)載體的構(gòu)建47-49
• 3.6.1 牦牛Ghrelin基因的獲取47-48
• 3.6.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒48-49
• 第四章 討論49-55
• 4.1 牦牛Ghrelin參與食欲和能量代謝基因的生物信息學(xué)特征49-50
• 4.2 牦牛Ghrelin參與食欲和能量代謝的表達(dá)特征50-51
• 4.3 牦牛Ghrelin參與能量代謝的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型51-55
• 第五章 結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-69
• 附錄69-70
• 在學(xué)期間的研究成果70-71
• 致謝71

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