本文關鍵詞：牦牛Ghrelin對其極端生境適應的分子機理

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【摘要】：牦牛是適應青藏高原高寒、低氧、枯草期慢長等極端自然環(huán)境而生存、繁衍和生產的大型哺乳動物之一。饑餓素(Ghrelin)是生長激素促分泌素受體的唯一內源性配體,也是唯一可以在外周刺激食欲的激素,其在“下丘腦—垂體—消化道”能量代謝系統(tǒng)中,作為“脂質傳感器”,通過“神經元突觸、迷走神經和血液循環(huán)”傳導,參與著機體食欲、體重、腸胃功能、脂肪、葡萄糖及脂類代謝等多項任務的調節(jié),最終在下丘腦協(xié)同調控機體的能量代謝。因此,為了探討青藏高原動物對其極端生態(tài)環(huán)境適應的遺傳機制,本論文以牦牛為研究對象,以低海拔黃牛為對照,以Ghrelin為靶點,通過基因克隆技術與序列比對分析、mRNA水平定量分析、蛋白定位及定量分析,并結合文獻挖掘和生物信息學研究方法構建牦牛Ghrelin參與能量代謝的基因調控網絡模型,系統(tǒng)探討了青藏高原牦牛Ghrelin對其極端生境適應的分子機理。結果1.本論文初步克隆了牦牛下丘腦Ghrelin基因CDS的全長序列,該序列僅含有一個351bp的開放閱讀框,其編碼117個氨基酸;牦牛Ghrelin基因CDS全長序列編碼的氨基酸序列與黃牛、綿羊、山羊和藏羚羊的同源性極高,分別為100%、91.38%、92.24%和92.24%;而與馬、驢、人、大鼠和小鼠的同源性較低,其分別為67.52%、68.38%、69.83%、70.09%和68.97%,且該氨基酸序列的系統(tǒng)進化情況與其親緣關系遠近一致。2.實時熒光定量PCR結果表明,牦牛和黃牛的下丘腦、垂體、皺胃和十二指腸中均有Ghrelin mRNA的表達,但表達趨勢不盡相同,其中牦牛皺胃和下丘腦Ghrelin mRNA的表達水平均極顯著地低于黃牛的(p0.001),分別為黃牛的0.5倍和0.7倍;而牦牛十二指腸和垂體Ghrelin mRNA的表達水平卻均極顯著地高于黃牛(p0.001),分別為黃牛的8倍(p0.001)和2倍。3.免疫組化結果表明,牦牛十二指腸、空腸、回腸和盲腸中均有Ghrelin免疫陽性產物的分布,大量陽性產物主要分布于小腸腺分泌細胞,而在小腸腺腺泡基底膜上僅有少量分布;然而,在對照組黃牛中該陽性產物主要表達于黏膜層小腸腺腺泡基底膜。此外,免疫熒光結果表明,十二指腸Ghrelin蛋白的紅色熒光標記物分布特征與免疫組化的相一致。4.ELISA分析結果表明,在牦牛和黃牛下丘腦、垂體、皺胃和十二指腸中Ghrelin蛋白總表達量(Total levels,TL)的表達趨勢一致,即TL皺胃TL十二指腸TL垂體TL下丘腦;但牦牛上述各組織Ghrelin蛋白的表達水平均極顯著地高于黃牛的(p0.001)。5.在牦牛Ghrelin參與能量代謝的基因調控網絡模型中,Ghrelin通過與其受體GHSR直接或間接互作協(xié)同參與機體能量代謝調控的基因有NPY、AgRP、GOAT、Insulin、GHRH、Leptin、Motilin、Orexin、OX1R、OX2R、GH、MC4R、POMC、CCK和PYY共計16個。6.成功構建了牦牛Ghrelin CDS編碼序列的真核熒光表達質粒pEGFP-Ghrelin。結論1.在反芻動物的進化中,Ghrelin的氨基酸序列具有極高的保守性,其與生境特征沒有必然的聯(lián)系。2.與低海拔黃牛相比,牦牛在高寒、低氧、枯草期漫長等極端高原生境適應的能量代謝調控中,“下丘腦-垂體-消化道”軸高表達的Ghrelin蛋白,可能通過提高食欲促進進食、增加脂肪積累、調控體溫、降低能量消耗,而適應其極端生境。3.在牦牛Ghrelin參與能量代謝的基因調控網絡模型中,與Ghrelin通過其受體GHSR相互綁定直接互作協(xié)同參與機體能量代謝調控的基因有NPY、AgRP、GOAT、Insulin、GHRH和Leptin 6個,其中前5個參與能量平衡的正調控,Leptin參與能量平衡的負調控;與Ghrelin間接互作協(xié)同參與機體能量代謝調控的基因有Motilin、Orexin、OX1R、OX2R、GH、MC4R、POMC、CCK、CCKAR、CCKBR和PYY共計11個,其中前5個參與能量平衡的正調控,后6個參與能量平衡的負調控。其為進一步系統(tǒng)探討青藏高原草食動物尤其牦牛適應其極端生境Ghrelin參與能量代謝的基因調控網絡奠定了一定的理論基礎。
【關鍵詞】：青藏高原 牦牛 能量代謝 神經調控 饑餓素
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S823.85
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-11
• 第一章 文獻綜述11-24
• 1.1 牦牛及其能量代謝特征11-12
• 1.1.1 牦牛11
• 1.1.2 青藏高原生境特征11
• 1.1.3 青藏高原動物/牦牛能量代謝特征11-12
• 1.2 能量代謝與神經調控12-15
• 1.2.1 下丘腦12-15
• 1.2.2 腺垂體15
• 1.3 Ghrelin15-23
• 1.3.1 Ghrelin的結構組成及其加工15-18
• 1.3.2 Ghrelin的定位18-19
• 1.3.3 Ghrelin的�；�19-20
• 1.3.4 Ghrelin的功能20-23
• 1.4 小結23-24
• 第二章 實驗材料與方法24-36
• 2.1 實驗材料24-27
• 2.1.1 實驗動物24
• 2.1.2 載體與菌株24
• 2.1.3 實驗主要試劑24-25
• 2.1.4 溶液配制25-26
• 2.1.5 實驗儀器26-27
• 2.2 實驗方法27-36
• 2.2.1 牦牛Ghrelin基因CDS序列的克隆27-29
• 2.2.1.1 腦牛下丘腦總RNA的提取27-29
• 2.2.2 Real-Time Quantitative PCR29-31
• 2.2.3 石蠟切片及免疫組織化學染色31-33
• 2.2.4 免疫熒光化學染色33
• 2.2.5 ELISA33
• 2.2.6 牦牛下丘腦能量代謝相關因子調控網絡模型構建33
• 2.2.7 牦牛Ghrelin基因高效真核表達載體構建33-36
• 第三章 實驗結果36-49
• 3.1 牦牛Ghrelin基因CDS序列的克隆36-39
• 3.1.1 牦牛總RNA提取及凝膠電泳分析36
• 3.1.2 牦牛Ghrelin基因的PCR擴增36-37
• 3.1.3 牦牛Ghrelin基因克隆及重組子鑒定37
• 3.1.4 牦牛Ghrelin氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析37-39
• 3.2 牦牛Ghrelin基因mRNA水平的表達研究39-40
• 3.3 牦牛Ghrelin蛋白在小腸及大腸的免疫組織化學定位40-44
• 3.3.1 Ghrelin在牦牛十二指腸中的定位41-42
• 3.3.2 Ghrelin在牦�？漳c中的定位42
• 3.3.3 Ghrelin在牦牛回腸中的定位42-43
• 3.3.4 Ghrelin在牦牛盲腸中的定位43-44
• 3.4 牦牛Ghrelin的蛋白定量研究44
• 3.5 牦牛下丘腦Ghrelin參與能量代謝的調控網絡模型44-47
• 3.5.1 Ghrelin44-45
• 3.5.2 NPY45-46
• 3.5.3 瘦素（Leptin）46
• 3.5.4 膽囊收縮素（CCK）46-47
• 3.5.5 食欲素（Orexin）47
• 3.6 牦牛Ghrelin基因高效真核表達載體的構建47-49
• 3.6.1 牦牛Ghrelin基因的獲取47-48
• 3.6.2 重組質粒的構建及鑒48-49
• 第四章 討論49-55
• 4.1 牦牛Ghrelin參與食欲和能量代謝基因的生物信息學特征49-50
• 4.2 牦牛Ghrelin參與食欲和能量代謝的表達特征50-51
• 4.3 牦牛Ghrelin參與能量代謝的基因調控網絡模型51-55
• 第五章 結論55-56
• 參考文獻56-69
• 附錄69-70
• 在學期間的研究成果70-71
• 致謝71

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