發(fā)布時間：2017-09-15 10:33

  本文關鍵詞：F2代抗PCV2轉(zhuǎn)基因豬的抗病力分析

  更多相關文章： PCV2 轉(zhuǎn)基因豬 抗病力 病毒拷貝數(shù) 血常規(guī)

【摘要】：豬圓環(huán)病毒(Porcine Circovirus,PCV)在分類學上為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬,是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小動物病毒之一。它含有共價閉合的單股環(huán)狀負鏈DNA,基因組大小約為1.76Kb。已知的PCV共有兩個血清型,即PCV1和PCV2,PCV1為非致病性病毒;PCV2為多種豬常見疾病的病原,感染后導致機體免疫抑制,與其它病原體一起引起混合感染或繼發(fā)感染,另外該病毒的感染具有持續(xù)性長的特點,使疾病長期存在難以根除,給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的損失。目前對于該病毒的控制主要以注射PCV2疫苗和加強生產(chǎn)管理為主。隨著分子生物學技術的發(fā)展,借助新的分子育種技術獲得抗PCV2豬已成為可能。本實驗室利用RNA干擾技術(RNA interference,RNAi)結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術成功培育出F0代抗PCV2轉(zhuǎn)基因豬,并且在分子水平和細胞水平驗證了其抗病性。本研究以F1代轉(zhuǎn)基因公豬與野生型母豬雜交獲得的F2代抗PCV2轉(zhuǎn)基因豬為對象,分別從DNA水平、RNA水平及活體水平對其遺傳表達穩(wěn)定性、抗PCV2感染效果進行檢測與分析,以獲得安全、有效的抗PCV2轉(zhuǎn)基因豬新品種。主要結(jié)果如下:(1)經(jīng)生物熒光燈、PCR檢測,出生的37頭F2代豬中有26頭轉(zhuǎn)基因豬,陽性率達70.2%,外源基因能夠穩(wěn)定遺傳。(2)si RNA在轉(zhuǎn)基因豬體內(nèi)能夠表達,不同個體同一組織的si RNA表達量存在顯著差異(P0.01)。(3)利用PCV2加免疫刺激物的方式對仔豬攻毒可引起PMWS癥狀,血清病毒數(shù)較低時,轉(zhuǎn)基因豬具有一定的抗病毒效果。(4)攻毒后,四組抗體水平都先下降后回升。A組(轉(zhuǎn)基因直接感染組)和C組(轉(zhuǎn)基因接觸組)的回升速度分別快于B組(野生型直接感染組)和D組(野生型接觸組),且在第56天C組抗體水平顯著高于D組。(5)血常規(guī)結(jié)果顯示,A組和B組、C組和D組各個時期各項血液指標都沒有顯著性差異(p0.05)。該結(jié)果說明,轉(zhuǎn)基因豬和野生型豬機體的新陳代謝和功能調(diào)節(jié)基本保持一致。(6)攻毒期間豬只各個時期的體重結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因豬和野生型體重沒有差異(p0.05)。(7)攻毒后采集仔豬組織器官進行免疫組化實驗的結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因和野生型豬中PCV2蛋白的沉積沒有差異。綜上所述,所獲得的轉(zhuǎn)基因豬都能表達抑制PCV2的siRNA;活體攻毒后豬只血清抗體先下降后上升,血清病毒數(shù)較低時,轉(zhuǎn)基因豬具有一定的抗病毒效果;血常規(guī)結(jié)果表明,外源基因的轉(zhuǎn)入不影響豬只的新陳代謝和機體機能。
【關鍵詞】：PCV2 轉(zhuǎn)基因豬 抗病力 病毒拷貝數(shù) 血常規(guī)
【學位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.28
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 1 前言10-14
• 1.1 豬圓環(huán)病毒病原學及其相關疾病的簡介10-11
• 1.2 目前對于豬圓環(huán)病毒病的防治措施11-12
• 1.3 利用RNAi技術和轉(zhuǎn)基因技術培育抗圓環(huán)病毒豬新品種的研究進展12-14
• 1.4 研究的目的及意義14
• 2 材料與方法14-23
• 2.1 實驗材料14
• 2.1.1 實驗動物和PCV2毒株14
• 2.2 實驗方法14-23
• 2.2.1 利用熒光燈觀察EGFP蛋白在抗PCV2轉(zhuǎn)基因豬中的表達情況15
• 2.2.2 利用PCR方法檢測目的基因在轉(zhuǎn)基因豬中的整合15-16
• 2.2.3 利用莖環(huán)引物法檢測不同轉(zhuǎn)基因豬腎臟小RNA轉(zhuǎn)錄表達情況16-23
• 2.2.4 數(shù)據(jù)分析23
• 3 結(jié)果與分析23-37
• 3.1 F2代轉(zhuǎn)基因豬綠色熒光蛋白基因的表達檢測23-24
• 3.2 F2代轉(zhuǎn)基因豬PCR鑒定24-25
• 3.3 F2代轉(zhuǎn)基因豬腎組織抗PCV2 siRNA表達檢測25-26
• 3.4 F2代轉(zhuǎn)基因豬與對照豬抗PCV2感染能力比較26-37
• 3.4.1 攻毒前PCV2病毒滴度測定26-27
• 3.4.2 攻毒前血清抗原和抗體水平檢測27-28
• 3.4.3 攻毒后血液PCV2病毒拷貝數(shù)變化28-31
• 3.4.4 攻毒后血液生化指標的變化31-33
• 3.4.5 攻毒后體重變化33-35
• 3.4.6 攻毒后血清中PCV2抗體水平的變化35-36
• 3.4.7 攻毒結(jié)束后組織免疫組化學分析36-37
• 4 討論與結(jié)論37-43
• 4.1 RNAi技術在抗病毒育種上的應用37-39
• 4.2 轉(zhuǎn)基因動物的檢測39-40
• 4.3 PCV2活體攻毒實驗存在的難點和解決途徑40-41
• 4.4 本研究中轉(zhuǎn)基因豬抗PCV2效果的探討41
• 4.5 結(jié)論41-43
• 致謝43-44
• 參考文獻44-48
• 附錄A48-50
• 附錄B50-51

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 楊利勇;李春鳳;;豬圓環(huán)病毒2型在我國的流行及疫苗研究現(xiàn)狀[J];畜牧與獸醫(yī);2015年04期

2 陳少康;王曉鳳;李爽;郭峰;王瑩;云鵬;;豬血常規(guī)指標輔助評價健康種豬的初步研究[J];吉林畜牧獸醫(yī);2015年03期

3 何世斌;柴連琴;譚s，

本文編號：856012