本文關(guān)鍵詞：豬瘟病毒蛋白對其3’UTR的調(diào)節(jié)作用

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【摘要】：豬瘟(Classical swine fever)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引發(fā)的一種疾病,具有高致病性和高傳染性,可對豬類養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失,被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類疾病。豬瘟病毒是一種單股正鏈RNA病毒,其基因組包括一個開放閱讀框(open reading frame,ORF),一個3’端非編碼區(qū)(3’untranslated region,3’UTR)和一個5’端非編碼區(qū)(5’untranslated region,5’UTR)。豬瘟病毒的開放閱讀框編碼一個由3898個氨基酸所組成的多聚蛋白,該多聚蛋白可在病毒自身蛋白酶和宿主細胞信號肽酶的水解和修飾作用下形成12個成熟的蛋白,包括C、Erns、E1、E2、Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。豬瘟病毒基因組的復制過程需要多種自身非結(jié)構(gòu)蛋白的參與,研究表明NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B是豬瘟病毒RNA復制所必需的。豬瘟病毒3’UTR的二級結(jié)構(gòu)包括4或5個莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stem loop,SL),對病毒RNA的復制和翻譯有著重要作用。為了研究豬瘟病毒各個蛋白對其3’UTR在翻譯水平的調(diào)節(jié)作用,本研究構(gòu)建了豬瘟病毒各蛋白的真核表達載體和3’UTR的熒光素酶表達載體,并將各蛋白的真核表達載體分別與3’UTR的熒光素酶表達載體共轉(zhuǎn)染至PK-15細胞,利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分析各蛋白對3’UTR的功能是否具有調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示豬瘟病毒C、NS4A、NS5A和NS5B蛋白對其3’UTR的功能具有顯著的調(diào)節(jié)作用。其中C蛋白和NS5B蛋白可以顯著降低3’UTR的翻譯抑制功能,因此推測C蛋白和NS5B蛋白對病毒的翻譯起到促進作用;而NS4A、NS5A蛋白可以促進3’UTR的翻譯抑制功能,推測對病毒的翻譯起到抑制作用。為了進一步研究豬瘟病毒C蛋白對其3’UTR在翻譯水平的調(diào)節(jié)作用,首先研究C蛋白在3’UTR上的具體調(diào)節(jié)位點。通過構(gòu)建3’UTR不同莖環(huán)區(qū)域調(diào)控下的熒光素酶表達載體,并與C蛋白的真核表達載體共轉(zhuǎn)染后,發(fā)現(xiàn)C蛋白對其3’UTR的調(diào)節(jié)位點主要定位于3’UTR的1-139nt區(qū)(SL-1和SL-2)。同時也研究了豬瘟病毒C蛋白對3’UTR發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的主要功能區(qū)域。利用生物信息學對C蛋白進行分析,發(fā)現(xiàn)59-69位氨基酸為C蛋白的氨基酸保守區(qū),對該區(qū)域進行缺失突變后,利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分析,結(jié)果顯示豬瘟病毒C蛋白的59-69位氨基酸對于C蛋白在3’UTR的調(diào)節(jié)過程中起到較為重要的作用�？傊�,本研究利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒C蛋白對其3’UTR在翻譯水平的功能具有顯著的抑制作用,推測對病毒的翻譯可起到促進作用,且該調(diào)節(jié)作用主要定位于3’UTR的1-139nt(SL-1和SL-2)區(qū)域;C蛋白中的第59-69位氨基酸在此調(diào)節(jié)作用中發(fā)揮了較為重要的作用。
【關(guān)鍵詞】：豬瘟 豬瘟病毒 3’端非編碼區(qū) C蛋白
【學位授予單位】：山東師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.651
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 第一部分 背景介紹10-16
• 1 豬瘟（Classical swine fever）10
• 2 豬瘟病毒10-13
• 3 豬瘟病毒C蛋白的主要功能13-15
• 4 研究目的和意義15-16
• 第二部分 豬瘟病毒蛋白真核表達載體的構(gòu)建及其表達檢測16-48
• 1 材料16-23
• 1.1 載體、菌株和細胞系16
• 1.2 主要試劑16-17
• 1.3 溶液配制17-22
• 1.4 主要儀器設(shè)備22-23
• 2 方法23-41
• 2.1 引物的設(shè)計與合成23-24
• 2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與提取24-37
• 2.3 細胞的復蘇與培養(yǎng)37-38
• 2.4 細胞的轉(zhuǎn)染38-39
• 2.5 Western Blot39-41
• 3 結(jié)果41-47
• 3.1 豬瘟病毒蛋白真核表達載體的構(gòu)建與鑒定41-46
• 3.2 豬瘟病毒蛋白的真核表達與檢測46-47
• 4 結(jié)論47-48
• 第三部分 豬瘟病毒蛋白對其 3’UTR功能發(fā)揮的影響48-53
• 1 材料48
• 1.1 載體、質(zhì)粒和細胞系48
• 1.2 主要試劑48
• 1.3 主要儀器設(shè)備48
• 2 方法48-49
• 2.1 細胞的復蘇與培養(yǎng)48
• 2.2 細胞轉(zhuǎn)染48-49
• 2.3 雙熒光素酶相對活性的檢測49
• 3 結(jié)果49-51
• 3.1 豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白對其 3’UTR功能發(fā)揮的影響49-50
• 3.2 豬瘟病毒非結(jié)構(gòu)蛋白對其 3’UTR功能發(fā)揮的影響50-51
• 4 討論51-53
• 第四部分 豬瘟病毒C蛋白對其 3’UTR功能發(fā)揮的影響53-64
• 1 材料53
• 2 方法53-56
• 2.1 豬瘟病毒 3’UTR及C蛋白的結(jié)構(gòu)及功能分析53-54
• 2.2 引物的設(shè)計與合成54
• 2.3 pCMV-C- deletion和pMIR105157重組質(zhì)粒的構(gòu)建與提取54-55
• 2.4 細胞的復蘇與培養(yǎng)55-56
• 2.5 細胞轉(zhuǎn)染56
• 2.6 western blot56
• 2.7 雙熒光素酶活性檢測56
• 3 結(jié)果56-62
• 3.1 豬瘟病毒 3’UTR SL-3 區(qū)域熒光素酶表達載體的構(gòu)建與鑒定56-57
• 3.2 豬瘟病毒C蛋白突變載體的構(gòu)建、表達與檢測57
• 3.3 豬瘟病毒C蛋白對其 3’UTR功能的影響57-62
• 4 討論62-64
• 參考文獻64-68
• 附錄68-75
• 致謝75

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本文編號：841237