本文關(guān)鍵詞：藍(lán)氏賈第蟲賈第素α-18和α-12基因的克隆、原核表達(dá)及其亞細(xì)胞定位

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【摘要】：藍(lán)氏賈第蟲是一種寄生于人和多種哺乳動物腸道內(nèi)的原蟲,可引起以腹瀉為主的賈第蟲病。該蟲具有高度發(fā)達(dá)的細(xì)胞骨架系統(tǒng),由微管、微絲和細(xì)胞骨架蛋白所構(gòu)成。研究證實(shí),賈第蟲的細(xì)胞骨架蛋白與其感染和致病有著密切關(guān)系。在參與細(xì)胞骨架構(gòu)成的眾多蛋白質(zhì)中,賈第素是其重要組成之一。賈第素的研究不僅有助于深入了解其致病機(jī)制,而且還可將其作為抗賈第蟲藥物的靶位。因此,本研究對賈第素α-18和α-12基因分別進(jìn)行克隆、表達(dá)及亞細(xì)胞定位分析。1.賈第素α-18基因的克隆、原核表達(dá)及其亞細(xì)胞定位。根據(jù)GenBank上參考序列設(shè)計(jì)引物,分別以賈第蟲A和F型基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增賈第素α-18編碼基因序列,分別亞克隆到pMD-18T載體,測序后利用相關(guān)軟件對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析;然后構(gòu)建pET28a-A(human)-AG-18(人源)和pET28a-F(cat)-AG-18(貓?jiān)?原核表達(dá)載體,將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosseta(DE3),對其誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blot分析,并用Ni-NTA親和層析柱純化融合蛋白;用純化的人源賈第素α-18融合蛋白免疫昆明小鼠制備多克隆抗體,然后采用間接免疫熒光法研究其在賈第蟲滋養(yǎng)體的亞細(xì)胞定位情況。結(jié)果顯示賈第素α-18基因全長為861 bp,人源與犬源A型賈第蟲同源性為100%,A型與F型同源性為86.8%;生物信息學(xué)分析表明,賈第素α-18為疏水性蛋白,無信號肽,無跨膜結(jié)構(gòu)域,含有11個α螺旋區(qū),13個β折疊區(qū),1個β轉(zhuǎn)角區(qū)和7個無規(guī)則卷曲;SDS-PAGE及Western-blot分析顯示賈第素α-18融合蛋白相對分子質(zhì)量約為36 kDa,且反應(yīng)原性良好;獲得的可溶性蛋白濃度分別為1.18 mg/mL和1.5 mg/mL;制備的抗血清效價高達(dá)1:25600以上,細(xì)胞定位顯示其主要分布于滋養(yǎng)體的四對鞭毛,表明賈第素α-18是一種與鞭毛相關(guān)的蛋白。上述信息為賈第素α-18的功能研究奠定了基礎(chǔ)。2.賈第素α-12基因的克隆、原核表達(dá)及其亞細(xì)胞定位。根據(jù)GenBank上參考序列設(shè)計(jì)特異性引物,以賈第蟲A型基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增賈第素α-12編碼基因序列,亞克隆到pMD-18T載體,測序后利用相關(guān)軟件對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析;然后構(gòu)建pET28a-AG-12原核表達(dá)載體,將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌,對其誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blot分析,并用Ni-NTA親和層析柱純化融合蛋白;用純化的人源賈第素α-12融合蛋白免疫昆明小鼠制備多克隆抗體;然后采用間接免疫熒光法研究其在滋養(yǎng)體的亞細(xì)胞定位情況。結(jié)果顯示賈第素α-12基因序列長為972 bp,編碼323個氨基酸,與參考基因序列(XM_001708393)同源性達(dá)100%;生物信息學(xué)分析表明,賈第素α-12為親水性蛋白,無信號肽,無跨膜結(jié)構(gòu)域,含有5個α螺旋區(qū),1個β折疊區(qū),4個β轉(zhuǎn)角區(qū)和4個無規(guī)則卷曲;SDS-PAGE及Western-blot分析顯示賈第素α-12融合蛋白相對分子質(zhì)量約為40 kDa,且反應(yīng)原性良好,獲得的可溶性蛋白濃度為0.86 mg/mL;制備的抗血清效價高達(dá)1:25600以上,細(xì)胞定位顯示其主要分布于滋養(yǎng)體的細(xì)胞質(zhì),表明賈第素α-12是一種與胞質(zhì)相關(guān)的蛋白。上述信息為賈第素α-12的功能研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：藍(lán)氏賈第蟲 賈第素α-18 賈第素α-12 原核表達(dá) 純化 亞細(xì)胞定位
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.7
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 英文縮寫對照表8-14
• 1 前言14-17
• 2 材料與方法17-41
• 2.1 材料17-23
• 2.1.1 樣品17
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)動物17
• 2.1.3 菌種17
• 2.1.4 載體17-18
• 2.1.5 酶和試劑18
• 2.1.6 主要儀器18-19
• 2.1.7 培養(yǎng)基和常用溶液的配置19-23
• 2.2 方法23-41
• 2.2.1 藍(lán)氏賈第蟲賈第素 α-18 的原核表達(dá)及其亞細(xì)胞定位23-37
• 2.2.1.1 A型藍(lán)氏賈第蟲滋養(yǎng)體的培養(yǎng)23
• 2.2.1.2 基因組DNA提取23-24
• 2.2.1.3 引物設(shè)計(jì)24
• 2.2.1.4 賈第素 α-18 基因擴(kuò)增24-25
• 2.2.1.5 PCR產(chǎn)物檢測25
• 2.2.1.6 PCR產(chǎn)物回收與純化25-26
• 2.2.1.7 PCR純化產(chǎn)物的連接26-27
• 2.2.1.8 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α27
• 2.2.1.9 陽性克隆的篩選與PCR鑒定27
• 2.2.1.10 陽性克隆質(zhì)粒的抽提27-28
• 2.2.1.11 陽性克隆序列的測定及分析28
• 2.2.1.12 賈第素 α-18 的生物信息學(xué)分析28-29
• 2.2.1.13 目的基因片段粘性末端的制備29
• 2.2.1.14 表達(dá)載體質(zhì)粒p ET-28a(+) 的線性化29-30
• 2.2.1.15 目的基因與線性化p ET-28a(+) 的連接30
• 2.2.1.16 重組連接體系的轉(zhuǎn)化30-31
• 2.2.1.17 重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定31
• 2.2.1.18 賈第素 α-18 基因的原核表達(dá)31-32
• 2.2.1.19 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析32-33
• 2.2.1.20 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot檢測33
• 2.2.1.21 目的蛋白的純化33-34
• 2.2.1.22 純化蛋白濃度的檢測34-35
• 2.2.1.23 賈第素 α-18 多克隆抗體的制備35
• 2.2.1.24 免疫血清效價的測定35-36
• 2.2.1.25 抗血清的特異性鑒定36
• 2.2.1.26 賈第素 α-18 在賈第蟲滋養(yǎng)體內(nèi)的亞細(xì)胞定位36-37
• 2.2.2 藍(lán)氏賈第蟲賈第素 α-12 的原核表達(dá)及其亞細(xì)胞定位37-41
• 2.2.2.1 引物設(shè)計(jì)37
• 2.2.2.2 賈第素 α-12 基因擴(kuò)增37-38
• 2.2.2.3 PCR產(chǎn)物檢測38
• 2.2.2.4 PCR產(chǎn)物回收與純化38
• 2.2.2.5 PCR純化產(chǎn)物的連接38
• 2.2.2.6 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α38
• 2.2.2.7 陽性克隆的篩選與PCR鑒定38-39
• 2.2.2.8 陽性克隆質(zhì)粒的抽提39
• 2.2.2.9 陽性克隆質(zhì)粒的測序39
• 2.2.2.10 賈第素 α-12 的生物信息學(xué)分析39
• 2.2.2.11 目的基因片段粘性末端的制備39
• 2.2.2.12 目的基因與線性化載體p ET-28a(+) 的連接39
• 2.2.2.13 重組連接體系的轉(zhuǎn)化39
• 2.2.2.14 重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定39-40
• 2.2.2.15 賈第素 α-12 基因的原核表達(dá)40
• 2.2.2.16 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析40
• 2.2.2.17 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot檢測40
• 2.2.2.18 目的蛋白的純化40
• 2.2.2.19 純化蛋白濃度的檢測40
• 2.2.2.20 賈第素 α-12 多克隆抗體的制備40
• 2.2.2.21 抗血清效價的測定40
• 2.2.2.22 抗血清的特異性鑒定40
• 2.2.2.23 賈第素 α-12 在賈第蟲滋養(yǎng)體內(nèi)的亞細(xì)胞定位40-41
• 3 結(jié)果與分析41-57
• 3.1 賈第素 α-18 的原核表達(dá)及其亞細(xì)胞定位41-51
• 3.1.1 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果41
• 3.1.2 陽性克隆PCR鑒定結(jié)果41-42
• 3.1.3 目的基因測序結(jié)果及序列同源性比對分析42-44
• 3.1.4 賈第素 α-18 的生物信息學(xué)分析44-46
• 3.1.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定46-47
• 3.1.6 表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析47-48
• 3.1.7 表達(dá)產(chǎn)物Western-blot分析48
• 3.1.8 重組蛋白的純化48-49
• 3.1.9 抗血清效價的測定49-50
• 3.1.10 抗血清特異性分析50
• 3.1.11 賈第素 α-18 在賈第蟲滋養(yǎng)體的亞細(xì)胞定位50-51
• 3.2 賈第蟲賈第素 α-12 的原核表達(dá)及其亞細(xì)胞定位51-57
• 3.2.1 賈第素 α-12 基因的擴(kuò)增結(jié)果51-52
• 3.2.2 陽性克隆PCR鑒定結(jié)果52
• 3.2.3 基因序列的測定及生物信息學(xué)分析52-54
• 3.2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定54
• 3.2.5 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析54-55
• 3.2.6 表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot分析55
• 3.2.7 重組蛋白的純化55
• 3.2.8 抗血清效價的測定55-56
• 3.2.9 抗血清特異性分析56
• 3.2.10 賈第素 α-12 在賈第蟲滋養(yǎng)體的亞細(xì)胞定位56-57
• 4 討論57-63
• 4.1 不同宿主賈第蟲A型和F型賈第素 α-18 基因的遺傳變異57-58
• 4.2 賈第蟲賈第素 α-18 的原核表達(dá)及其亞細(xì)胞定位58-60
• 4.3 賈第蟲賈第素 α-12 的原核表達(dá)及其亞細(xì)胞定位60-63
• 全文總結(jié)63-64
• 致謝64-65
• 參考文獻(xiàn)65-70
• 附錄：攻讀碩士學(xué)位期間論文發(fā)表、學(xué)術(shù)會議及獲獎情況70-71

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 武省;李國清;;藍(lán)氏賈第蟲致病機(jī)制的研究進(jìn)展[J];中國動物傳染病學(xué)報;2015年01期

2 王洋;王沂;楊文思;李冀;余源;沈海娥;劉青;田喜鳳;;藍(lán)氏賈第鞭毛蟲α-4賈第素特異性多克隆抗體的制備及免疫電鏡定位研究[J];中國病原生物學(xué)雜志;2012年12期

3 王中全,崔晶;賈第蟲病流行病學(xué)研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué)(寄生蟲病分冊);2005年03期

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本文編號：837904