本文關(guān)鍵詞：ANK1基因在弓形蟲生長發(fā)育中的作用研究

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【摘要】：弓形蟲是一種宿主范圍廣泛的人畜共患寄生蟲,可感染包括人在內(nèi)的所有溫血動物,全世界約有四分之一的人口感染弓形蟲病。免疫力正常的宿主感染弓形蟲后,在宿主免疫壓力的作用下,弓形蟲會在宿主體內(nèi)轉(zhuǎn)變成緩殖子,以組織包囊形式存在,造成機體的終生慢性感染。當機體的免疫力下降時,包囊內(nèi)的緩殖子會再活化,形成速殖子,造成宿主急性感染。弓形蟲速殖子與緩殖子相互轉(zhuǎn)化在弓形蟲病傳播與發(fā)病中起到重要作用。在弓形蟲速殖子與緩殖子相互轉(zhuǎn)化過程中,約有400個基因的表達會發(fā)生明顯變化,但是這些基因在緩殖子形成中的作用仍不清楚,而鑒定它們在緩殖子形成中的作用可以為理解緩殖子發(fā)育的分子機制奠定基礎,,為弓形蟲疫苗設計提供理論依據(jù)。本研究選取一個含有三十四肽重復結(jié)構(gòu)域的緩殖子期上調(diào)基因ANK1,利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將ANK1基因在PRU株中敲除,獲得了ANK1基因缺失株,通過比較敲除株與野生株生長、復制和毒力的差異,發(fā)現(xiàn)與野生株相比,敲除株在生長、復制和毒力方面均有缺陷。具體工作包括以下幾個方面:(1)ANK1蛋白N-端及全長的原核表達構(gòu)建pE-SUMO-ANK1-Nter和pE-SUMO-ANK1原核表達質(zhì)粒,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細胞中并進行原核表達。在37℃誘導條件下,ANK1蛋白N端和全長均能得到高效表達,但ANK1蛋白全長主要以包涵體的形式存在。優(yōu)化誘導表達條件發(fā)現(xiàn),當大腸桿菌OD600值達1.5時,16℃用終濃度為0.1mM的IPTG誘導可提高蛋白在上清中的表達量。(2)ANK1敲除株的構(gòu)建利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對ANK1基因進行敲除。首先,構(gòu)建ANK1基因特異性CRISPR質(zhì)粒pSAG1-Cas9-U6-ANK1和同源模板質(zhì)粒pANK1-DHFR,然后將同源模板片段和pSAG1-Cas9-U6-ANK1質(zhì)粒共電轉(zhuǎn)到PRU速殖子中,用乙胺嘧啶進行篩選并用限制稀釋法在96孔板中獲取單克隆,經(jīng)擴大培養(yǎng)后用PCR進行鑒定,結(jié)果顯示成功獲得ANK1敲除株。(3)ANK1敲除株表型研究通過空斑實驗比較敲除株和野生株生長的差異,發(fā)現(xiàn)敲除株的生長明顯比野生株慢;通過復制實驗比較野生株和敲除株在蟲體復制方面的差異,發(fā)現(xiàn)與野生株相比敲除株在復制方面有明顯的缺陷;通過小鼠毒力實驗比較野生株和敲除株對小鼠的毒力情況,發(fā)現(xiàn)與野生株相比,敲除株的毒力明顯下降。小鼠保護力實驗顯示,經(jīng)ANK1敲除株免疫的小鼠對致死劑量的野生型蟲株有很好的抗性,證明了敲除株的免疫保護性為100%。(4)RNA-seq尋找野生株與敲除株的基因表達差異體外培養(yǎng)敲除株和野生株獲得速殖子,體外堿性誘導敲除株和野生株形成緩殖子,提取速殖子和緩殖子RNA,利用RNA-seq尋找野生株與敲除株表達量有差異的基因。本研究中,共找到430個緩殖子期敲除株和野生株表達量有差異的基因;510個速殖子期敲除株和野生株表達有差異的基因。本研究利用CRISPR/Cas技術(shù)將ANK1基因在PRU中進行敲除,成功獲得單克隆敲除株。與野生株P(guān)RU比較發(fā)現(xiàn),敲除株在生長、復制和小鼠毒力方面有明顯的缺陷,并且敲除株對小鼠具有很好的保護力,有成為基因工程疫苗的潛力。通過RNA-seq發(fā)現(xiàn)敲除株和野生株在緩殖子期有430個基因的表達量有明顯差異,而在速殖子期有510個基因的表達量有明顯差異,為進一步研究ANK1影響弓形蟲生長發(fā)育的分子機制奠定了基礎。
【關(guān)鍵詞】：弓形蟲 ANK1 CRISPR/Cas9 RNA-seq 緩殖子發(fā)育
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.7
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 縮略語表11-12
• 1．文獻綜述12-21
• 1.1 弓形蟲綜述12-14
• 1.1.1 弓形蟲與弓形蟲病12
• 1.1.2 弓形蟲生活史12-13
• 1.1.3 弓形蟲病治療與疫苗13-14
• 1.2 弓形蟲緩殖子分化發(fā)育研究進展14-18
• 1.2.1 弓形蟲緩殖子形成14-15
• 1.2.2 宿主細胞對弓形蟲緩殖子發(fā)育的影響15
• 1.2.3 弓形蟲自身調(diào)控機制對緩殖子分化發(fā)育的影響15-18
• 1.3 三十四肽重復結(jié)構(gòu)域研究進展18-19
• 1.4 CRISPR/CAS9系統(tǒng)研究進展19-21
• 2．研究目的與意義21-22
• 3．材料與方法22-36
• 3.1 實驗材料22-23
• 3.1.1 實驗動物22
• 3.1.2 實驗菌株、蟲株與細胞22
• 3.1.3 載體與質(zhì)粒22
• 3.1.4 引物22-23
• 3.2 主要儀器與試劑23-25
• 3.2.1 主要儀器23
• 3.2.2 主要試劑盒23
• 3.2.3 主要試劑23-24
• 3.2.4 主要溶液的配制24-25
• 3.3 實驗方法25-36
• 3.3.1 弓形蟲的體外培養(yǎng)25
• 3.3.2 弓形蟲基因組DNA的提取25-26
• 3.3.3 弓形蟲RNA的提取26
• 3.3.4 弓形蟲cDNA的制備26-27
• 3.3.5 基因敲除相關(guān)質(zhì)粒的構(gòu)建27-29
• 3.3.6 重組蛋白的原核表達29
• 3.3.7 His融合蛋白的鎳柱純化29-30
• 3.3.8 純化蛋白的透析與保存30
• 3.3.9 BCA法蛋白質(zhì)濃度測定30-31
• 3.3.10 ANK1敲除株的構(gòu)建及鑒定31-33
• 3.3.11 空斑實驗33
• 3.3.12 復制實驗33
• 3.3.13 弓形蟲蟲株毒力實驗33-34
• 3.3.14 弓形蟲腦包囊計數(shù)34
• 3.3.15 敲除株對小鼠保護力實驗34
• 3.3.16 體外誘導弓形蟲緩殖子形成34-35
• 3.3.17 RNA-seq檢測敲除株與野生株基因表達差異35-36
• 4．結(jié)果與分析36-55
• 4.1 弓形蟲ANK1蛋白N-端及全長原核表達、蛋白純化36-41
• 4.1.1 ANK1基因N-端及全長片段擴增36
• 4.1.2 ANK1基因N-端及全長表達質(zhì)粒構(gòu)建36-37
• 4.1.3 ANK1蛋白N-端及全長原核表達37-39
• 4.1.4 ANK1蛋白全長表達條件的優(yōu)化39
• 4.1.5 ANK1蛋白N-端及全長蛋白純化39-41
• 4.2 ANK1敲除質(zhì)粒的構(gòu)建41-45
• 4.2.1.pANK1-DHFR質(zhì)粒的構(gòu)建41-43
• 4.2.2 ANK1敲除株的構(gòu)建43-44
• 4.2.3 ANK1敲除株鑒定44-45
• 4.3 ANK1敲除株表型研究45-50
• 4.3.1 空斑實驗45
• 4.3.2 復制實驗45-46
• 4.3.3 毒力實驗46-47
• 4.3.4 小鼠腦包囊形成實驗47-48
• 4.3.5 不同劑量敲除株對小鼠毒力48-49
• 4.3.6 小鼠保護力實驗49-50
• 4.4 RNA-seq檢測ANK1敲除株與野生株基因表達差異50-55
• 4.4.1 野生株和敲除株速殖子與緩殖子RNA樣本的制備50-51
• 4.4.2 RNA-seq檢測敲除株與野生株基因表達量差異51-55
• 5．討論55-59
• 5.1 弓形蟲ANK1蛋白N-端及全長的原核表達55
• 5.2 弓形蟲ANK1基因敲除株的構(gòu)建及表型研究55-57
• 5.3 RNA-seq檢測敲除株與野生株基因差異性表達57-59
• 6．結(jié)論59
• 7．展望59-60
• 參考文獻60-67
• 致謝67-68

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本文編號：829268