發(fā)布時間：2017-09-10 23:23

  本文關(guān)鍵詞：環(huán)形病毒AGV2的檢測及其VP1-3基因表達(dá)

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【摘要】：雞傳染性貧血病毒(CAV)是圓環(huán)病毒科環(huán)形病毒屬中最早被鑒定,也是目前該屬中唯一經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)分離到的成員。自2011年,CAV相關(guān)的環(huán)形病毒序列AGV2,不僅在雞體中被鑒定,而且在人的皮膚棉試、血液以及糞便樣品中被檢測到。提示,研究AGV2具有潛在的公共衛(wèi)生意義。那么,AGV2是否與CAV一樣,對雛雞具有致病性,能誘導(dǎo)免疫抑制?AGV2在國內(nèi)雞群的分子流行情況又是如何?這些問題均有待進(jìn)一步闡明。為探究國內(nèi)雞群及人群中是否存在AGV2,建立檢測AGV2血清學(xué)診斷方法,本研究對揚(yáng)州部分活禽市場雞群及人群血清樣本進(jìn)行了AGV2檢測,并對陽性樣品進(jìn)行了AGV2的VP1、VP2、VP3基因克隆,原核、真核表達(dá)及多抗的制備。本研究的開展,首次明確了國內(nèi)活禽市場雞群及人群存在AGV2。AGV2的VP1、VP2、VP3的原核及真核表達(dá)載體及產(chǎn)物的獲得,具有良好反應(yīng)性的抗VP2和VP3的小鼠多克隆抗體制備,為建立AGV2血清學(xué)檢測方法以及探究AGV2的VP2和VP3蛋白分子生物學(xué)特性打下了基礎(chǔ)。1.國內(nèi)活禽市場及人群AGV2的檢測為明確國內(nèi)雞群及人群中是否存在AGV2,首先建立了檢測AGV2的PCR方法。以TA克隆陽性質(zhì)粒為模版進(jìn)行的靈敏度檢測發(fā)現(xiàn),該P(yáng)CR擴(kuò)增AGV2的靈敏度可達(dá)2.7個拷貝數(shù)。對4個不同的活禽市場共54份雞群羽囊組織樣品以及人的178份血樣樣品的檢測發(fā)現(xiàn)12個AGV2陽性樣品,其中10個來自活禽市場雞群,另2個來自人血清樣品。4個不同活禽市場雞群AGV2的陽性率分別為25%,12.5%,15.8%以及20%；人血清樣品AGV2的陽性率為1.1%。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),本研究檢測到的12個AGV2序列間的同源性為98.3%-100%,而與NCBI數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的AGV2序列的同源性在92.2%-99.1%。值得注意的是,這12個AGV2序列與NCBI中AGV2原型株Ave3以及國內(nèi)人源株China的相應(yīng)序列的同源性分別僅為92.2%-93%以及93%-93.9%,而與檢測于人及雪貂的CL33,G13和915F06007相應(yīng)序列的同源性達(dá)99.1%。進(jìn)化樹進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),國內(nèi)檢測到AGV2可以分為兩個分支。另外,在一腫瘤發(fā)病雞群的診斷與檢測中發(fā)現(xiàn),AGV2與CAV以及MDV存在共感染。這些研究結(jié)果表明,國內(nèi)活性市場雞群確實(shí)存在環(huán)形病毒AGV2,并被發(fā)現(xiàn)于人血清樣品中。然AGV2的分子流行,致病性,與CAV、MDV混合感染對CAV以及MDV致病性的影響等尚待進(jìn)一步研究。2.AGV2的VP1、VP2、VP3蛋白原核表達(dá)及多抗制備為獲得建立AGV2血清學(xué)診斷用抗原,對AGV2的VP1、VP2、VP3蛋白進(jìn)行了原核表達(dá)。利用商品化的重組酶ExnaseTM Ⅱ不經(jīng)酶切,直接將VP1、VP2、VP3基因或片段的PCR產(chǎn)物分別與線性化的pGEX-6p-1載體進(jìn)行快速重組構(gòu)建了GST-VP1_1-462, GST-VP1_463-924,GST-VP1_925-1383,GST-VP1_735-1089,GST-VP2_1-348,GST-VP2_348-750以及GST-VP3等7個GST融合表達(dá)質(zhì)粒。相應(yīng)陽性克隆轉(zhuǎn)化BL21后,用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE以及Western blot分析結(jié)果表明,GST-VP1463-924, GST-VP1735-1089, GST-VP21-348以及GST-VP3的表達(dá)產(chǎn)物具有可溶性,而其它蛋白主要以包涵體形式存在�？扇苄訥ST-VP21-348以及GST-VP3蛋白經(jīng)GST柱純化后,GST-VP2_1-348以及GST-VP3蛋白濃度分別為1.6mg/ml及1.0mg/ml。純化的GST-VP2_1-348以及GST-VP3蛋白經(jīng)免疫小鼠,分別獲得了ELISA效價(jià)達(dá)1萬的抗GST-VP2以及GST-VP3的小鼠多克隆抗體。這些AGV2的VP1、VP2、VP3原核表達(dá)載體的構(gòu)建,表達(dá)產(chǎn)物及多抗的獲得為進(jìn)一步建立AGV2血清學(xué)診斷方法提供了原核表達(dá)抗原,為研究AGV2生物學(xué)特性提供了試劑。3.AGV2的VP2, VP3蛋白真核表達(dá)及其特性為進(jìn)一步探究AGV2的VP2及VP3生物學(xué)功能,對AGV2的VP2及VP3基因進(jìn)行了真核表達(dá)。利用商品化的重組酶ExnaseTM Ⅱ不經(jīng)酶切,直接將VP2以及VP3基因PCR產(chǎn)物分別與線性化的pcDNA3.1(+)載體進(jìn)行重組連接構(gòu)建了pcDNA3.1-VP2以及pcDNA3.1-VP3真核表達(dá)質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞36小時后,進(jìn)行Western blot分析。、以抗GST-VP3以及GST-VP2_1-348的小鼠多克隆抗體為一抗進(jìn)行的Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-VP2以及pcDNA3.1-VP3質(zhì)粒的293T細(xì)胞中分別出現(xiàn)分子量大小為34kDa,14KDa的蛋白特異性條帶。同時構(gòu)建了EGFP-VP3融合表達(dá)載體。EGFP-VP3轉(zhuǎn)染HCT116結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),EGFP-VP3定位于細(xì)胞核內(nèi),且呈散在的點(diǎn)狀分布,類似凋亡小體。這些AGV2的VP2以及VP3真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)不僅為建立AGV2血清學(xué)診斷方法提供了真核表達(dá)抗原,而且為進(jìn)一步研究AGV2 VP2及VP3功能打下了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：環(huán)形病毒AGV2 檢測 VP1、VP2、VP3原核表達(dá) 多抗制備 VP2、VP3真核表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 符號說明9-10
• 文獻(xiàn)綜述 新型環(huán)形病毒AGV2研究進(jìn)展10-16
• 1 AGV2的發(fā)現(xiàn)10-11
• 2 AGV2的檢測報(bào)道11-12
• 3 AGV2基因組結(jié)構(gòu)及蛋白功能12-14
• 4 本研究的目的和意義14-16
• 研究一 國內(nèi)環(huán)形病毒AGV2的檢測16-26
• 1 材料16-17
• 2 方法17-20
• 3 結(jié)果20-24
• 4 小結(jié)與討論24-26
• 研究二 環(huán)形病毒AGV2的VP1-3蛋白的原核表達(dá)26-41
• 1 材料26
• 2 方法26-33
• 3 結(jié)果33-39
• 4 小結(jié)與討論39-41
• 研究三 AGV2的VP2,VP3蛋白的真核表達(dá)及特性41-51
• 1 材料41
• 2 方法41-46
• 3 結(jié)果46-50
• 4 小結(jié)與討論50-51
• 全文總結(jié)51-52
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文56-57
• 致謝57-58

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1 王森;興區(qū)動監(jiān)部門專項(xiàng)整治活禽市場[N];盤錦日報(bào);2008年

2 記者 天笑;所有活禽市場暫時關(guān)閉[N];蘇州日報(bào);2013年

3 吳濤 王攀;活禽市場出路在哪？[N];中國食品安全報(bào);2013年

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5 記者 董峻 呂諾;世衛(wèi)專家:活禽市場是人感染主要來源地[N];新華每日電訊;2013年

6 特約記者 黃巧萍 通訊員 王建平;廣東活禽市場一月一休市[N];健康報(bào);2013年

7 記者 蘇菁;蘇州活禽市場未“解禁”[N];蘇州日報(bào);2013年

8 記者 李小維;兩節(jié)市場防“禽”不留死角[N];蘭州日報(bào);2005年

9 本報(bào)記者 李海濤;關(guān)閉活禽市場要慎行[N];農(nóng)民日報(bào);2014年

10 ;滬今起關(guān)閉活禽市場，，暫�；钋萁灰譡N];新華每日電訊;2013年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 田曉彥;環(huán)形病毒AGV2的檢測及其VP1-3基因表達(dá)[D];揚(yáng)州大學(xué);2016年

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本文編號：827261