發(fā)布時間：2017-09-09 09:51

  本文關鍵詞：mTOR信號通路在牛乳腺上皮細胞甘油三脂和脂肪酸合成中的作用

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【摘要】：乳脂肪含量與組成是構成牛奶重要營養(yǎng)品質(zhì)的主要物質(zhì)基礎之一。牛乳脂肪的主要成分是甘油三酯,乳腺細胞以細胞內(nèi)合成和胞外攝取兩種形式獲得脂肪酸并進一步合成甘油三酯。乳脂合成過程受到乳腺細胞內(nèi)外營養(yǎng)因素和信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)控,其中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin, mTOR)信號通路起著重要的作用。奶牛乳腺炎是一種奶牛常見病,影響牛奶中甘油三酯含量和脂肪酸的組成,無乳鏈球菌(S.agalactiae)是奶牛乳腺炎的重要病原體之一。本研究以奶牛乳腺上皮細胞為模型；研究在胰島素刺激條件下和無乳鏈球菌侵染時,細胞中甘油三酯和脂肪酸合成的變化情況,并對mTOR信號通路在其中所起作用進行初步探討。本實驗通過乳汁分離法得到純化的奶牛乳腺上皮細胞,(1)通過抑制劑(rapamycin)和RNA干擾技術抑制mTOR信號通路活性,或過表達Rheb激活mTOR信號通路,western blot檢測甘油三酯合成關鍵酶的表達、ELISA檢測甘油三酯含量以及軟質(zhì)酸、DHA的變化；(2)胰島素刺激奶牛乳腺上皮細胞,ELISA檢測甘油三脂含量變化,GC-MS檢測細胞內(nèi)37種脂肪酸含量的變化；(3)無乳鏈球菌侵染奶牛乳腺上皮細胞,ELISA檢測甘油三脂含量變化,GC-MS檢測細胞內(nèi)37種脂肪酸含量變化。結(jié)果表明：(1) mTOR信號通路特異性抑制劑rapamycin顯著抑制奶牛乳腺上皮細胞的增殖(p0.01). mTOR信號通路活性和甘油三脂合成關鍵酶DGAT1的表達；(2) 100 nM rapamycin處理奶牛乳腺上皮細胞8 h,軟脂酸、DHA和甘油三脂的含量都有明顯下降(p0.01); (3) Rheb基因轉(zhuǎn)錄后沉默,降低mTOR信號通路活性和甘油三脂合成關鍵酶Lipin1和DGAT1的表達,甘油三脂合成減少(p0.05)；(4)過表達Rheb基因,增強]mTOR信號通路活性和Lipin1和DGAT1的表達,甘油三脂合成增多(p0.01); (5) 5 mg/ml胰島素刺激細胞12h,甘油三酯合成量與對照組相比,有顯著性提高(p0.05), rapamycin對這一過程有抑制作用；(6)胰島素誘導細胞內(nèi)脂肪酸的合成；(7)短時間(2 h)無乳鏈球菌侵染細胞誘導甘油三酯合成和分泌(p0.01),使脂肪酸的組成發(fā)生變化。綜上所述,本實驗證明mTOR信號通路在牛乳腺上皮細胞甘油三脂和脂肪酸合成中發(fā)揮正向調(diào)控作用,其機制可能是調(diào)控了合成過程中關鍵酶的表達。胰島素誘導細胞內(nèi)甘油三酯和脂肪酸的合成,而無乳鏈球菌侵染則導致細胞內(nèi)脂肪酸組成發(fā)生變化。這些過程中有mTOR信號通路參與,具體機制還需進一步研究。
【關鍵詞】：mTOR信號通路 甘油三酯 乳脂合成 胰島素 無乳鏈球菌
【學位授予單位】：內(nèi)蒙古大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S823
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文縮略詞表10-12
• 第一章 文獻綜述12-22
• 1.1 雷帕霉素(rapamycin)和mTOR信號通路12-14
• 1.1.1 吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)及其代謝產(chǎn)物雷帕霉素12-13
• 1.1.2 mTOR信號通路13-14
• 1.2 奶牛乳腺上皮細胞及其原代培養(yǎng)14-15
• 1.2.1 奶牛乳腺上皮細胞的分離14-15
• 1.2.2 原代培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞的意義15
• 1.3 mTOR信號通路在乳脂合成中的調(diào)控作用15-19
• 1.3.1 對脂質(zhì)合成基因表達相關轉(zhuǎn)錄因子SREBPs和PPARs的調(diào)控作用16
• 1.3.2 在脂肪酸從頭合成中的作用16-17
• 1.3.3 在長鏈脂肪酸攝取和轉(zhuǎn)運中的作用17-18
• 1.3.4 在脂肪酸酯化和甘油三酯合成中的作用18-19
• 1.4 無乳鏈球菌以及奶牛乳腺炎19-22
• 第二章 mTOR信號通路在乳脂合成中的調(diào)控作用22-47
• 2.1 材料22-23
• 2.1.1 細胞系以及質(zhì)粒22
• 2.1.2 主要試劑及儀器22-23
• 2.2 方法23-33
• 2.2.1 乳汁分離法分離奶牛乳腺上皮細胞23-24
• 2.2.2 rapamycin對奶牛乳腺上皮細胞增殖的影響24
• 2.2.3 rapamycin處理奶牛乳腺上皮細胞后對mTOR信號通路的影響24-25
• 2.2.4 rapamycin處理奶牛乳腺上皮細胞后對超長鏈脂肪酸延伸酶以及甘油三脂合成關鍵酶的影響25
• 2.2.5 rapamycin處理奶牛乳腺上皮細胞后對脂肪酸以及甘油三脂合成的影響25-26
• 2.2.6 Rheb基因轉(zhuǎn)錄后沉默對甘油三脂合成的影響26-29
• 2.2.7 Rheb基因過表達對甘油三脂合成的影響29-33
• 2.3 實驗結(jié)果33-46
• 2.3.1 乳汁分離法分離得到奶牛乳腺上皮細胞33
• 2.3.2 rapamycin抑制奶牛乳腺上皮細胞增殖且具有時間依賴性33-34
• 2.3.3 rapamycin處理奶牛乳腺上皮細胞抑制mTOR信號通路的活性34-35
• 2.3.4 rapamycin抑制ELOVL1和DGAT1的表達35-36
• 2.3.5 rapamyciny抑制軟脂酸、DHA和甘油三脂的合成36-37
• 2.3.6 Rheb基因轉(zhuǎn)錄后沉默抑制甘油三脂合成37-41
• 2.3.7 Rheb基因過表達促進甘油三脂合成41-46
• 2.4 討論46-47
• 第三章 mTOR信號通路介導胰島素信號對奶牛乳腺上皮細胞甘油三酯和脂肪酸合成的影響47-53
• 3.1 材料47
• 3.1.1 細胞系47
• 3.1.2 主要試劑及儀器47
• 3.2 實驗方法47-49
• 3.2.1 胰島素處理時間與處理濃度的優(yōu)化47
• 3.2.2 胰島素對奶牛乳腺上皮細胞中甘油三脂合成的影響47-48
• 3.2.3 胰島素對奶牛乳腺上皮細胞中的脂肪酸合成的影響48-49
• 3.3 實驗結(jié)果49-52
• 3.3.1 胰島素促進甘油三脂合成具有時間依賴性49-50
• 3.3.2 rapamycin抑制胰島素誘導的甘油三脂合成50
• 3.3.3 rapamycin抑制胰島素誘導的脂肪酸合成50-52
• 3.4 討論52-53
• 第四章 無乳鏈球菌侵染對奶牛乳腺上皮細胞甘油三酯和脂肪酸合成的影響53-59
• 4.1 材料53
• 4.1.1 細胞系以及菌株53
• 4.1.2 主要試劑及儀器53
• 4.2 實驗方法53-55
• 4.2.1 無乳鏈球菌侵染奶牛乳腺上皮細胞的條件優(yōu)化53-54
• 4.2.2 無乳鏈球菌侵染對奶牛乳腺上皮細胞中甘油三脂合成的影響54
• 4.2.3 無乳鏈球菌侵染對奶牛乳腺上皮細胞中脂肪酸合成的影響54-55
• 4.3 實驗結(jié)果55-57
• 4.3.1 無乳鏈球菌侵染奶牛乳腺上皮細胞的條件優(yōu)化55
• 4.3.2 短時間無乳鏈球菌侵染誘導奶牛乳腺上皮細胞甘油三脂的合成和分泌55-56
• 4.3.3 短時間無乳鏈球菌侵染影響細胞內(nèi)脂肪酸的組成56-57
• 4.4 討論57-59
• 結(jié)論59-60
• 參考文獻60-68
• 致謝68-69
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文69-70
• 附錄70-77

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5 李吉霞;葛秀國;王文秀;張涌;;牛乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2012年07期

6 符梅;熊顯榮;高川;李宇;王樹茂;李鍵;;麥洼牦牛乳腺上皮細胞系的建立及其生物學特性[J];西北農(nóng)業(yè)學報;2012年11期

7 郝明超;劉r，

本文編號：819757