發(fā)布時間：2017-09-08 07:10

  本文關(guān)鍵詞：雞生殖干細胞中Piwi基因的干涉效率

  更多相關(guān)文章： Piwi基因 siRNA shRNA PGCs RNAi

【摘要】：【目的】針對禽類干細胞研究中,存在轉(zhuǎn)染效率與干涉效率低下的問題,通過比較不同干涉方式對雞原始生殖細胞(primordial germ cells,PGCs)中Piwi基因的干涉效果,探討提高禽類生殖干細胞干涉效率的有效方法。為進一步研究Piwi基因參與干細胞自我更新、RNA沉默以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程等生物學功能研究奠定基礎(chǔ)�！痉椒ā扛鶕�(jù)已建立的原代細胞分離技術(shù),分別從健康雞群的10日齡和4日齡雞胚中分離成纖維細胞(chicken embryo fibroblast,CEF)與生殖脊,其中CEF作為PGCs細胞的飼養(yǎng)層,生殖脊經(jīng)Trypsin-EDTA室溫下消化獲得PGCs細胞,并通過形態(tài)學、化學方法(PAS糖原染色、AKP活性檢測)和免疫學方法(TERT抗體、SSEA-1抗體)對其進行鑒定。根據(jù)Genbank公布的雞Piwi基因的m RNA序列(NM_001098852),利用在線軟件分別靶向不同位點設(shè)計合成得到3個小片段的stealth si RNAs,并將通用無義序列BLOCK-i T~(TM) Alexa Fluor#174;Red Fluorescent Oligo作為熒光素標記的陰性對照si RNA。同時,在線設(shè)計三條干擾序列和一條非特異性陰性對照序列,將其插入線性化空載體p RNA-U6.1,構(gòu)建不同的sh RNA干涉載體。分別采用不同類型的轉(zhuǎn)染試劑將構(gòu)建好的si RNA和sh RNA轉(zhuǎn)染PGCs細胞。首先利用通用無義si RNA以及僅帶有GFP熒光標記基因的sh RNA載體作為陰性對照,檢測si RNA和sh RNA轉(zhuǎn)染效率,確定最佳轉(zhuǎn)染條件。其次,將試驗組si RNA和sh RNA在優(yōu)化條件下轉(zhuǎn)染PGCs細胞,分別收集轉(zhuǎn)染了24、48、72和144 h這4個時間點的細胞,提取各個時間段的總RNA,采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測Piwi基因m RNA表達水平,并用SPSS軟件分析不同處理組的差異�！窘Y(jié)果】在對原代分離的PGCs細胞進行了形態(tài)學、化學以及免疫學方法鑒定后,確認其所獲得的細胞為PGCs細胞且狀態(tài)良好。根據(jù)不同的轉(zhuǎn)染試劑量與si RNA或sh RNA載體量的配比,得出si RNA轉(zhuǎn)染最優(yōu)條件為si RNA㑳Lipofectamine TM 2000=50 pmol㑳2μL;sh RNA轉(zhuǎn)染最優(yōu)條件為sh RNA㑳X-Treme GENE HP DNA Transfection Reagent=500 ng㑳1.5μL。在以上最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件下,將試驗組si RNA和sh RNA分別轉(zhuǎn)染第二代PGCs細胞。發(fā)現(xiàn)在si RNA干涉組中,陰性si RNA組和空白組相比,Piwi基因表達量在24、48、72和144 h差異均不顯著(P0.05);而3個試驗組si RNA與陰性對照組相比,在24、48和72 h的Piwi基因表達量均呈現(xiàn)顯著下降(P0.05),但在144 h時表達差異不顯著(P0.05)。在sh RNA干涉組中,空白組和陰性對照組相比,Piwi基因表達量在4個時間點上差異均不顯著(P0.05);而3個試驗組與陰性對照組相比,Piwi基因表達量在4個時間點上均顯著下降(P0.05)。與si RNA干涉試驗組相比,sh RNA載體表現(xiàn)出更強及更長時間的穩(wěn)定抑制Piwi基因的效果�！窘Y(jié)論】si RNA與sh RNA均能較好抑制目的基因的m RNA表達,不同干涉效果表明采用sh RNA載體具有更好及更長時間的抑制作用,這為RNAi技術(shù)在家禽生殖干細胞中的應(yīng)用研究提供基礎(chǔ)資料。
【作者單位】： 揚州大學動物科學與技術(shù)學院;
【關(guān)鍵詞】： Piwi基因 siRNA shRNA PGCs RNAi
【基金】：國家自然科學基金(31372297,31301966) 國家科技支撐計劃項目(2015BAD03B03)
【分類號】：S831
【正文快照】： 0引言【研究意義】Piwi基因是Argonaute家族的一個亞家族,參與干細胞自我更新、RNA沉默以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程[1]。Piwi基因在原始生殖細胞(primordialgerm cell,PGCs)中為特異性表達,且容易體外獲得與培養(yǎng),在生殖干細胞的維持和精子發(fā)生方面發(fā)揮著重要作用[2]。雞PGCs具有發(fā)育的

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王紅鋼;林波;汪文利;;不同轉(zhuǎn)染條件影響質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的探討[J];河南大學學報(醫(yī)學版);2012年02期

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 郜瑞;李靈君;石慧;趙霞霞;;RNA干擾及其在藥物靶標識別和確證中的應(yīng)用[J];安徽農(nóng)學通報;2008年17期

2 彭文培;曾長軍;;精子發(fā)生及冷凍過程中表觀遺傳調(diào)控的研究進展[J];中國畜牧獸醫(yī);2014年09期

3 趙炎蔥;李景華;劉敏;;畢赤酵母工程菌在不同培養(yǎng)基中生長的研究[J];河南大學學報(醫(yī)學版);2013年04期

4 徐晨;宋寧;;精子發(fā)生過程中的表觀遺傳學調(diào)控[J];中華男科學雜志;2014年05期

5 Hsueh-Yen Ku;Haifan Lin;;PIWI proteins and their interactors in piRNA biogenesis,germline development and gene expression[J];National Science Review;2014年02期

6 戴鵬;茍?zhí)m濤;劉默芳;;PIWI/piRNA“機器”與雄性生殖細胞發(fā)育[J];生命的化學;2014年04期

7 夏明秀;常國斌;陳蓉;翟飛;戴愛琴;馬騰;王洪志;徐璐;陳靜;劉璐;陳國宏;;雞Piwil1基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的初步分析[J];畜牧獸醫(yī)學報;2013年09期

8 徐璐;陳蓉;徐琪;翟飛;陳靜;王洪志;常國斌;陳國宏;;Piwil1基因在雞生殖系干細胞中的表達研究[J];中國家禽;2014年07期

9 李建超;張穎;戴愛琴;王洪志;翟飛;華登科;夏明秀;常國斌;陳國宏;;體外抑制Piwi基因?qū)﹄u原始生殖細胞相關(guān)基因表達的影響[J];畜牧獸醫(yī)學報;2014年06期

10 陳靜;翟飛;夏明秀;陳蓉;徐琪;常國斌;李建超;馬騰;王洪志;徐璐;劉璐;陳國宏;;雞不同生精細胞中Piwil1基因啟動子區(qū)DNA甲基化差異研究[J];畜牧獸醫(yī)學報;2014年09期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 朱春富;MyD88基因沉默的不成熟樹突狀細胞延長大鼠小腸移植受體的存活時間[D];南京醫(yī)科大學;2009年

2 劉軍桂;FXYD6在胰腺癌中的表達及生物學作用[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2008年

3 練兵;鼻咽癌眼部癥狀及聯(lián)合轉(zhuǎn)染siRNA對鼻咽癌細胞基因抑制的研究[D];暨南大學;2009年

4 曲華偉;RNAi抑制人膽囊癌VEGF基因表達及其對膽囊癌細胞生長與侵襲影響的實驗研究[D];中南大學;2010年

5 蘇雪婷;miR-138、miR-30家族新靶標的確證及生物學功能研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2013年

6 曹慧秋;Notch受體信號通路抑制caspase及非caspase依賴的凋亡并介導YB-1的凋亡抑制作用[D];中南大學;2013年

7 陳蓉;禽類Piwill基因與piRNAs生物學功能的初步研究[D];揚州大學;2013年

8 王貴栓;NXF3和CaMKIV在精子發(fā)生過程中的功能研究[D];中國科學技術(shù)大學;2014年

9 劉珂;Tudor結(jié)構(gòu)域蛋白識別甲基化精氨酸蛋白的分子機理研究[D];華中師范大學;2012年

10 周學;文昌魚microRNA及其合成代謝相關(guān)蛋白的識別、鑒定及比較基因組分析[D];南京師范大學;2014年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 賈慧麗;PIWIL2基因在肝癌組織中mRNA及蛋白的表達[D];鄭州大學;2013年

2 李明桂;牛睪丸組織b-Boule基因表達的甲基化調(diào)控研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2012年

3 程敏;沉默Piwil2增強子宮頸癌細胞對順鉑敏感性的機制研究[D];安徽醫(yī)科大學;2013年

4 蘇暢;PIWIL4基因?qū)θ藢m頸癌HeLa細胞生長的影響及其機制研究[D];天津醫(yī)科大學;2010年

5 溫松奇;PIWIL2在肝門部膽管癌和膽管癌細胞中的表達及臨床意義[D];華中科技大學;2013年

6 張麗燕;半滑舌鰨piwil2和pik3r1基因的克隆與表達分析[D];大連海洋大學;2014年

7 翟飛;雞弱精子癥發(fā)生的形成因素及其與Piwil1基因的關(guān)聯(lián)研究[D];揚州大學;2014年

8 曾賢彬;犏牛精子發(fā)生阻滯的比較轉(zhuǎn)錄組研究[D];西南民族大學;2014年

9 李冠儒;Caspase-3在乙醇致睪丸損傷中的表達及意義[D];鄭州大學;2014年

10 王龍蓉;HIWI影響肝細胞癌轉(zhuǎn)移復發(fā)的機制及其預后價值的研究[D];復旦大學;2013年

【二級參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 許期年;王秀云;左劍玲;王中;;3種脂質(zhì)體介導法轉(zhuǎn)染大鼠小膠質(zhì)細胞的比較研究[J];山東醫(yī)藥;2011年04期

【相似文獻】

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 茍?zhí)m濤;趙爽;劉默芳;;PIWI蛋白在后期精子細胞中泛素化修飾降解為精子形成所必需[A];細胞—生命的基礎(chǔ)——中國細胞生物學學會2013年全國學術(shù)大會·武漢論文摘要集[C];2013年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 廖珍;家蠶和蜜蜂中Piwi蛋白基因的克隆與表達譜分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2009年

，

本文編號：812595