本文關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素B1降解菌株的篩選鑒定、降解優(yōu)化與特性研究

  更多相關(guān)文章： 黃曲霉毒素B1 降解菌株 篩選鑒定 發(fā)酵優(yōu)化 降解特性

【摘要】：黃曲霉毒素對(duì)畜禽健康與生產(chǎn)有極大危害,危及食物終端人類的安全,因此毒素的解毒研究刻不容緩。生物降解法對(duì)原料不造成二次污染、具有較高特異性、同時(shí)阻止毒素重新合成,因此是一種高效、安全的去毒方法。本研究從樣品中篩選出高效降解的AFB1的菌株,結(jié)合表型鑒定、分子鑒定菌株種屬；研究其對(duì)致病菌的抑制作用、對(duì)抗生素的敏感性、對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的毒性作用,評(píng)價(jià)其安全性；優(yōu)化菌株的生長(zhǎng)條件；對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分、發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行單因素優(yōu)化,最顯著因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn),確定最優(yōu)發(fā)酵條件,使菌株達(dá)到最佳降解能力；初步判斷高效降解菌株對(duì)AFB1的降解機(jī)理,確認(rèn)降解成分所存在的部位；研究溫度、蛋白酶K對(duì)其穩(wěn)定性的影響,硫酸銨對(duì)活性成分進(jìn)行粗提取,檢測(cè)粗酶的降解活性,以下為試驗(yàn)主要的結(jié)果：1.香豆素初篩出33株生長(zhǎng)良好的菌株。結(jié)合HPLC復(fù)篩檢測(cè)得到菌株F6的降解率高達(dá)83.2%。菌體、菌落觀察及生理生化鑒定判斷屬于芽孢桿菌,16S rRNA序列比對(duì)分析結(jié)果,與ATCC700005核苷酸同源性為99.3%,判定F6菌株為蔬菜芽孢桿菌,命名為Bacillus oleronius GXO1 (GenBank KP297896)。2.蔬菜芽胞桿菌GX01對(duì)三種腸道致病菌具有良好抑制性,其中對(duì)沙門氏菌抑制等級(jí)最高,為++。對(duì)青霉素類、頭孢類、林可胺類藥物耐受,對(duì)磺胺類、喹諾酮類藥物最為敏感,對(duì)其余種類試驗(yàn)抗生素具有較高敏感性。灌胃1×l0l0CFU/(mL·kg)劑量以內(nèi)的蔬菜芽胞桿菌GX01對(duì)小鼠的增重、臟體比、血項(xiàng)指標(biāo)指標(biāo)及肝臟、腎臟結(jié)構(gòu)均無顯著影響。綜合上述三項(xiàng)結(jié)果說明蔬菜芽胞桿菌GX01的安全性高,具有應(yīng)用于生產(chǎn)的安全性基礎(chǔ)。3.蔬菜芽胞桿菌GX01在25-40℃、pH在5-8區(qū)間內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基生長(zhǎng)良好,34℃、pH為7繁殖力最旺盛；菌株GX01是需氧菌,三角瓶的裝液量越大,瓶中菌株的通氣量越小,對(duì)菌株的繁殖越不利；菌株GX01接種濃度在10%之內(nèi),菌株的繁殖力隨接菌濃度升高而增長(zhǎng),超過10%接菌濃度后繁殖力受抑制。4.蔬菜芽胞桿菌GX01分別在葡萄糖碳源、牛肉膏氮源、pH為8.0、6%接種量、100/250 mL裝液量、發(fā)酵48 h、37℃各單因素的條件試驗(yàn)中達(dá)到最佳降解效果,10mmo1/L Mg2+促進(jìn)蔬菜芽胞桿菌GX01對(duì)AFB1的降解力,10mmo1/LCu2+、Ca2+ Fe2+、 Mn2+、Zn2+、Al3+、Cd2+不同程度的抑制菌株的降解性能。5.在各單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上,以AFB1降解率作為設(shè)計(jì)響應(yīng)值,降解率影響顯著的初始pH、接種量、裝液量為試驗(yàn)因素,構(gòu)建的響應(yīng)面回歸模型得出AFB1最高降解率的各因素最佳理論值：初始pH為7.61、接種量6.29%、裝液量93.3 mL,試驗(yàn)驗(yàn)證在此優(yōu)化條件下發(fā)酵將AFB1降解率達(dá)提升至88.81%。6.發(fā)酵液上清液是蔬菜芽胞桿菌GX01對(duì)AFB1主要的降解部位,降解活性為83.0%,上清液加熱、加蛋白酶K后的降解活性顯著下降,僅為16.2%、23.9%,說明蔬菜芽胞桿菌GX01降解AFB1的物質(zhì)是胞體分泌至胞外的活性酶類。60%飽和度下硫酸銨鹽析上清液所沉淀出的粗酶對(duì)AFB1的降解性能最高達(dá)65.6%。通過分離鑒定得到的蔬菜芽胞桿菌GX01可高效降解AFB1,對(duì)其安全性、降解發(fā)酵條件優(yōu)化及降解活性部位的研究為今后的生產(chǎn)應(yīng)用提供安全依據(jù)及發(fā)酵理論參考,為該菌株對(duì)AFB 1生物降解的深入研究奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：黃曲霉毒素B1 降解菌株 篩選鑒定 發(fā)酵優(yōu)化 降解特性
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S859.87
【目錄】：

• 中文摘要9-11
• 英文摘要11-13
• 主要英文縮略語索引13-15
• 第一章 文獻(xiàn)綜述15-26
• 1.1 黃曲霉毒素的概況15-21
• 1.1.1 黃曲霉毒素的分類與結(jié)構(gòu)15
• 1.1.2 黃曲霉毒素的理化性質(zhì)15-16
• 1.1.3 黃曲霉毒素的產(chǎn)生與代謝16
• 1.1.4 黃曲霉毒素的危害16-19
• 1.1.5 黃曲霉毒素的污染與限量19-21
• 1.2 黃曲霉毒素的脫毒方法21-25
• 1.2.1 化學(xué)脫毒方法21
• 1.2.2 物理脫毒方法21-23
• 1.2.3 生物去毒法23-25
• 1.3 本課題研究意義25-26
• 第二章 AFB1高效降解菌株的篩選、鑒定與安全性研究26-47
• 2.1 材料與方法26-32
• 2.1.1 培養(yǎng)基配制26-27
• 2.1.2 主要試劑藥品27
• 2.1.3 主要儀器27-28
• 2.1.4 樣品28
• 2.1.5 試驗(yàn)菌株28
• 2.1.6 試驗(yàn)動(dòng)物28
• 2.1.7 AFB1降解菌株的分離篩選28-29
• 2.1.8 AFB1高效降解菌株的鑒定29-31
• 2.1.9 體外抑菌試驗(yàn)31
• 2.1.10 抗生素敏感性試驗(yàn)31
• 2.1.11 動(dòng)物毒性試驗(yàn)31-32
• 2.2 結(jié)果32-43
• 2.2.1 菌株初篩結(jié)果32
• 2.2.2 菌株復(fù)篩結(jié)果32-33
• 2.2.3 AFB1標(biāo)準(zhǔn)曲線33
• 2.2.4 AFB1的色譜圖33-34
• 2.2.5 F6菌株的形態(tài)鑒定34-35
• 2.2.6 F6菌株生理生化鑒定35-36
• 2.2.7 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果36-39
• 2.2.8 對(duì)致病菌的體外抑制結(jié)果39-40
• 2.2.9 藥敏試驗(yàn)結(jié)果40-41
• 2.2.10 毒性試驗(yàn)結(jié)果41-43
• 2.3 討論43-46
• 2.4 小結(jié)46-47
• 第三章 蔬菜芽孢桿菌GX01發(fā)酵優(yōu)化與降解特性研究47-66
• 3.1 材料與方法47-50
• 3.1.1 培養(yǎng)基47
• 3.1.2 主要試劑藥品47
• 3.1.3 主要儀器47
• 3.1.4 菌株GX01在NB培養(yǎng)基的生長(zhǎng)優(yōu)化47-48
• 3.1.5 菌株GX01降解AFB1的發(fā)酵培養(yǎng)基成分試驗(yàn)48-49
• 3.1.6 菌株GX01降解AFB1的發(fā)酵條件試驗(yàn)49
• 3.1.7 降解AFB1的Box-Benhken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)49
• 3.1.8 菌株GX01降解AFB1降解特性試驗(yàn)49-50
• 3.2 結(jié)果50-63
• 3.2.1 蔬菜芽孢桿菌GX01的生長(zhǎng)曲線51
• 3.2.2 培養(yǎng)條件對(duì)蔬菜芽胞桿菌GX01的生長(zhǎng)影響51-53
• 3.2.3 營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)菌株GX01發(fā)酵降解AFB1的影響53-55
• 3.2.4 發(fā)酵條件對(duì)菌株GX01降解AFB1的影響55-58
• 3.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)58-62
• 3.2.6 發(fā)酵液各組分對(duì)AFB1的降解62
• 3.2.7 加熱、蛋白酶K對(duì)菌株GX01活性組分降解AFB1的影響62-63
• 3.2.8 粗酶液對(duì)AFB1的降解63
• 3.3 討論63-65
• 3.4 小結(jié)65-66
• 結(jié)論66-67
• 參考文獻(xiàn)67-74
• 致謝74-75
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章75

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