本文關(guān)鍵詞：牦牛輪狀病毒的RT-PCR檢測方法的建立和應(yīng)用及病毒的分離培養(yǎng)

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【摘要】：犢牦牛腹瀉一直是青藏高原牦牛養(yǎng)殖業(yè)面臨的重要疾病,但由于病原學(xué)和流行病學(xué)資料匱乏,嚴(yán)重制約了該類疾病的防治。國內(nèi)外的研究表明,輪狀病毒(Rotavirus,RV)是重要的人畜致腹瀉病毒,牛輪狀病毒(Bovine rotavirus,BRV)是引起犢牛腹瀉的主要病原之一。本實(shí)驗(yàn)室前期用宏病毒組技術(shù)鑒定牦牛腹瀉相關(guān)病毒時,發(fā)現(xiàn)糞便樣本中存在RV,但用國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的3種檢測BRV的RT-PCR方法卻對測序證實(shí)的陽性樣本不能檢出,推測是由于病毒的序列變異所引起。本研究的目的是在研究牦牛RV VP6基因遺傳變異的基礎(chǔ)上,建立檢測牦牛RV的RT-PCR方法,應(yīng)用該方法對青藏高原牦牛腹瀉樣本進(jìn)行RV的流行病學(xué)調(diào)查并進(jìn)行病毒的分離鑒定。取得如下成果:1.檢測牦牛輪狀病毒的RT-PCR方法的建立RV VP6基因是11個基因節(jié)段中相對最保守的基因之一,是RV的主要分子檢測靶點(diǎn),但該基因的點(diǎn)突變會影響病毒的分子檢測。因此,采用Prime5.0軟件設(shè)計(jì)引物,首先從30個牦牛腹瀉樣本中擴(kuò)增得到14個位于931bp~1338bp牦牛RV VP6基因片段。序列分析發(fā)現(xiàn),與BRV相比,牦牛RV VP6基因在931bp~1110bp間出現(xiàn)多處點(diǎn)突變,而在1100bp~1338bp之間序列高度保守。據(jù)此設(shè)計(jì)檢測引物,成功建立了檢測牦牛RV的RT-PCR方法,具有良好的特異性和穩(wěn)定性,只擴(kuò)增出牦牛RV及BRV的特異片段,對其它無關(guān)病原無擴(kuò)增;檢測下限為0.45pg/μL,靈敏性較好。本方法對牦牛RV的檢出率明顯優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道的檢測BRV的RT-PCR方法,為牦牛RV病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了可靠的方法;該方法對肉牛腹瀉樣本中BRV的檢出也與其它方法具有很好的符合率,說明該方法也可以用于BRV的檢測。2.牦牛輪狀病毒的病原流行病學(xué)調(diào)查為調(diào)查RV在青藏高原牦牛中的流行情況,分別2014年6月和2015年8月采集了四川省阿壩州地區(qū)4個牧場、云南香格里拉地區(qū)4個牧場、青海玉樹地區(qū)5個牧場、西藏亞東地區(qū)6個牧場,共計(jì)234份犢牦牛("f3月齡)腹瀉糞便樣本,采用本實(shí)驗(yàn)建立的RT-PCR方法檢測了RV在腹瀉樣本中的分布。結(jié)果表明:234份犢牦牛腹瀉糞便樣本的RV檢出率為:西藏為60%(36/60)、青海為95%(57/60);四川為85.19%(46/54);云南為90%(54/60),證明牦牛RV感染是當(dāng)前導(dǎo)致犢牦牛腹瀉的重要原因。隨機(jī)抽取的四個地區(qū)的陽性樣本,對其VP6基因進(jìn)行測序并建立系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果顯示,不同地區(qū)的牦牛RV單獨(dú)的聚在一起,與BRV有明顯的遺傳距離,表明VP6的序列的變異與宿主有關(guān)。從四個地區(qū)的毒株分布來看,青海、西藏、云南的毒株分別單獨(dú)聚在一起,四川的毒株則分布在西藏和云南的毒株形成的分支中,似乎有一定的地域分布的趨勢,但還需要更多不同地域的毒株來驗(yàn)證。3.牦牛輪狀病毒的分離鑒定陽性樣本采用MA-104細(xì)胞進(jìn)行牦牛RV的分離鑒定。分離培養(yǎng)的5個毒株已傳代培養(yǎng)至第15代,沒有一株出現(xiàn)細(xì)胞病變。收集的每一代細(xì)胞毒,經(jīng)RT-PCR鑒定證實(shí)RV的存在。5個分離毒株均為I2基因型,其中有4個毒株擴(kuò)增出了VP4基因:3個分離毒株為P[11]基因型,1個分離毒株為P[14]基因型。采用文獻(xiàn)報(bào)道的多種方法均未能擴(kuò)增出VP7基因,推測是序列變異造成。本結(jié)果為進(jìn)一步研究牦牛RV的生物學(xué)特征奠定了基礎(chǔ)。綜上所述,本研究在對牦牛RV VP6基因遺傳變異分析的基礎(chǔ)上,成功建立了檢測牦牛RV的RT-PCR檢測方法,既可用于牦牛RV的快速診斷,又可用于BRV的快速診斷。病原流行病學(xué)調(diào)查表明,RV是牦牛腹瀉的重要原因。分離得到的牦牛RV為進(jìn)一步研究其生物學(xué)特征奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：牦牛 輪狀病毒 VP6基因 RT-PCR 流行病學(xué)調(diào)查 分離培養(yǎng)
【學(xué)位授予單位】：西南民族大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.653
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 前言11-12
• 第1章 牛輪狀病毒的分子生物學(xué)特性和檢測方法的研究進(jìn)展12-30
• 1 牛輪狀病毒主要蛋白的分子生物學(xué)特性及遺傳進(jìn)化分析13-25
• 1.1 VP3結(jié)構(gòu)蛋白的分子生物學(xué)特性及遺傳進(jìn)化分析14-15
• 1.2 VP4結(jié)構(gòu)蛋白的分子生物學(xué)特性及遺傳進(jìn)化分析15-18
• 1.3 VP6結(jié)構(gòu)蛋白的分子生物學(xué)特性及遺傳進(jìn)化分析18-21
• 1.4 VP7結(jié)構(gòu)蛋白的分子生物學(xué)特性及遺傳進(jìn)化分析21-23
• 1.5 NSP4非結(jié)構(gòu)蛋白的分子生物學(xué)特性及遺傳進(jìn)化分析23-25
• 2 牛輪狀病毒檢測方法的研究進(jìn)展25-30
• 2.1 牛輪狀病毒經(jīng)典檢測方法25-26
• 2.2 免疫學(xué)檢測方法26-27
• 2.3 基因檢測方法27-30
• 第2章 牦牛輪狀病毒RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用30-41
• 1 材料與方法30-33
• 1.1 病毒（菌）株、臨床樣本30-31
• 1.2 主要試劑及儀器31
• 1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成31
• 1.4 核酸的提取與cDNA合成31-32
• 1.5 牦牛RV陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備32
• 1.6 反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化32
• 1.7 敏感性測定32
• 1.8 特異性評價32
• 1.9 穩(wěn)定性評價32
• 1.10 四種RT-PCR方法的比較32-33
• 1.11 流行病學(xué)調(diào)查33
• 2 結(jié)果33-38
• 2.1 牦牛RV VP6基因片段序列的克隆及系統(tǒng)發(fā)育分析33-34
• 2.2 牦牛RV檢測引物的特異性34-35
• 2.3 優(yōu)化的RT-PCR反應(yīng)體系及條件35-36
• 2.4 特異性36
• 2.5 穩(wěn)定性36
• 2.6 本方法和文獻(xiàn)中報(bào)道的檢測BRV的方法的比較36
• 2.7 流行病學(xué)調(diào)查36-37
• 2.8 青藏高原四個地區(qū)的牦牛輪狀病毒VP6基因片段的遺傳進(jìn)化分析37-38
• 3 討論38-41
• 第3章 牦牛輪狀病毒的分離鑒定與分子生物學(xué)特征研究41-54
• 1 材料與試劑41-42
• 1.1 臨床樣本及培養(yǎng)細(xì)胞41
• 1.2 主要試劑及儀器41-42
• 2 牦牛輪狀病毒的分離培養(yǎng)及鑒定42-43
• 2.1 臨床樣本的前期處理42
• 2.2 病毒的分離培養(yǎng)42
• 2.3 分離病毒的RT-PCR鑒定42-43
• 3 分離毒株的VP4、VP6、VP7基因的克隆與遺傳進(jìn)化分析43-45
• 3.1 擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)43-44
• 3.2 分離毒株的VP4、VP6、VP7基因的擴(kuò)增與克隆測序44-45
• 3.3 分離毒株的VP4、VP6和VP7基因的同源性比對與遺傳進(jìn)化分析45
• 4 結(jié)果45-51
• 4.1 牦牛輪狀病毒的分離鑒定45-47
• 4.2 VP4基因的遺傳進(jìn)化分析47-48
• 4.3 VP6基因的遺傳進(jìn)化分析48-51
• 4.4 VP7基因擴(kuò)增結(jié)果51
• 5 討論51-54
• 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-63
• 附錄一63-64
• 致謝64-66

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