本文關(guān)鍵詞：柔嫩艾美耳球蟲鈣依賴蛋白激酶4功能特性的初步研究

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【摘要】：本文以對(duì)雞危害最為嚴(yán)重的E.tenella為研究對(duì)象,對(duì)E.tenella新基因EtCDPK4特性、酶活性及在E.tenella發(fā)育過程中所執(zhí)行的功能進(jìn)行了研究和分析,為探討E.tenella入侵宿主細(xì)胞的機(jī)制和研制高效、安全的抗球蟲疫苗和新藥物奠定基礎(chǔ)。1.柔嫩艾美耳球蟲鈣依賴蛋白激酶4基因的克隆及生物信息學(xué)分析利用3’-和5’-RACE技術(shù)獲得EtCDPK4的全長(zhǎng)cDNA序列,該序列大小是2 499 bp,包括5’-端185bp UTR序列,不含有CAAT和TATA序列;3’-端UTR序列,長(zhǎng)511 bp,含Ploy(A)尾,沒有典型AATAAA序列;ORF長(zhǎng)1 803 bp,編碼600個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)分子量68.3 kDa;對(duì)EtCDPK4編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)、疏水性、信號(hào)肽、理化性質(zhì)、抗原位點(diǎn)和保守功能模塊進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示:該基因編碼蛋白沒有信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域,可能有16個(gè)抗原位點(diǎn),推測(cè)具有良好抗原性。功能結(jié)構(gòu)域分析EtCDPK4可能含2個(gè)N-端糖基化位點(diǎn),3個(gè)N-端豆蔻酰化位點(diǎn),7個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn),10個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn),5個(gè)EF-Hand模體Ca2+結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該基因編碼蛋白具有CDPKs家族成員特征性保守結(jié)構(gòu)域。利用qRT-PCR檢測(cè)EtCDPK4在E.tenella 4個(gè)不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄水平差異,結(jié)果表明EtCDPK4在E.tenella孢子化卵囊和子孢子階段均有轉(zhuǎn)錄,且子孢子階段轉(zhuǎn)錄水平最高,與孢子化卵囊階段相比差異極顯著。2.柔嫩艾美耳球蟲鈣依賴蛋白激酶4重組蛋白表達(dá)及其特性的初步研究將EtCDPK4連接到原核表達(dá)載體pColdⅠ中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后,經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)可溶性重組蛋白His-EtCDPK4(rEtCDPK4)。利用Ni柱親和層析純化rEtCDPK4,純化的可溶性蛋白免疫新西蘭大白兔獲得兔抗重組蛋白多克隆抗體IgG,經(jīng)western-blot分析表明rEtCDPK4具有良好的抗原性。利用IFA技術(shù)對(duì)EtCDPK4天然蛋白在球蟲入侵DF-1細(xì)胞后不同發(fā)育階段分布和定位進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,該蛋白主要位于E.tenella子孢子和第二代裂殖子核前端膜表面;當(dāng)子孢子入侵DF-1細(xì)胞12 h后,蛋白主要位于蟲體頂端和帶蟲空泡膜上,此時(shí)表達(dá)量極速增加;子孢子入侵DF-1細(xì)胞36 h后,表達(dá)量下降,主要位于滋養(yǎng)體邊緣;蟲體剛發(fā)育至未成熟裂殖體時(shí),蛋白表達(dá)量迅速增加,蛋白均勻分布于整個(gè)蟲體,當(dāng)蟲體發(fā)育為中等階段未成熟裂殖體時(shí),表達(dá)量降低,發(fā)育為成熟裂殖體時(shí),表達(dá)量又迅速上升,綠色熒光強(qiáng)度變強(qiáng)變亮。E.tenella子孢子入侵DF-1細(xì)胞體外抑制實(shí)驗(yàn)顯示,使用兔抗rEtCDPK4多克隆抗體處理E.tenella子孢子后,與正常兔血清IgG對(duì)照組相比子孢子入侵DF-1活力顯著減弱,且隨著抗體處理子孢子濃度不斷增大,入侵細(xì)胞能力逐漸降低,當(dāng)抗體濃度為400μg/mL時(shí),抑制率高達(dá)52%。通過免疫印跡檢測(cè)E.tenella 4個(gè)發(fā)育階段EtCDPK4翻譯水平結(jié)果顯示,EtCDPK4蛋白在E.tenella 4個(gè)不同發(fā)育階段均有翻譯,但在E.tenella第二代裂殖子中翻譯水平最高。3.柔嫩艾美耳球蟲鈣依賴蛋白激酶4催化活性的初步研究通過構(gòu)建體外磷酸化反應(yīng)體系,探究了可溶性rEtCDPK4的酶催化活性特性、不同Ca2+濃度對(duì)rEtCDPK4酶活性大小影響以及rEtCDPK4酶活性特異性抑制劑的體外篩選和體內(nèi)臨床驗(yàn)證。結(jié)果表明,rEtCDPK4酶活性大小在0.87 nmol·min-1·ml-1左右;rEtCDPK4蛋白激酶活性正常發(fā)揮要完全依賴于酶活反應(yīng)體系中Ca2+,當(dāng)Ca2+濃度為0時(shí),rEtCDPK4沒有任何酶活性,不能夠使底物短多肽磷酸化,隨著酶活反應(yīng)緩沖溶液中Ca2+濃度不斷升高,可以明顯看到rEtCDPK4的酶反應(yīng)催化活性是不斷的增強(qiáng)的;通過體外磷酸化酶活性反應(yīng)的篩選和E.tenella子孢子體外入侵抑制實(shí)驗(yàn)的臨床驗(yàn)證,篩選出4種效果較好的EtCDPK4酶催化活性抑制劑,分別是:W-7、H-7、H-89以及Myristoylated Protein Kinase Peptide Inhibitor。這4種抑制劑都能夠在一定程度上有效抑制E.tenella子孢子入侵DF-1細(xì)胞的能力。4.柔嫩艾美耳球蟲鈣依賴蛋白激酶4相互作用底物的篩選為了獲得E.tenella子孢子或第二代裂殖子入侵階段EtCDPK4的相互作用蛋白,構(gòu)建了EtCDPK4的BD誘餌質(zhì)粒,利用酵母雙雜交技術(shù)將BD誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EtCDPK4篩選E.tenella子孢子或第二代裂殖子酵母雙雜交cDNA文庫(kù)獲得與EtCDPK4相互作用的底物蛋白。將構(gòu)建的BD誘餌蛋白進(jìn)行自激活活性、細(xì)胞毒性及誘餌蛋白c-Myc-EtCDPK4是否在宿主酵母菌中表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,構(gòu)建的酵母BD誘餌蛋白沒有自激活活性、細(xì)胞毒性且在酵母中能表達(dá),因此可用于酵母雙雜交篩選。通過使用BD誘餌蛋白對(duì)E.tenella子孢子或第二代裂殖子酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的篩選,在SD/-Ade/-Trp/-His/-Leu/X-α-GAL缺陷性固體培養(yǎng)基上共獲得88個(gè)藍(lán)色酵母單克隆菌落,其中80個(gè)成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10進(jìn)行測(cè)序;序列經(jīng)BLAST分析后,得到10個(gè)可能與EtCDPK4相互作用的蛋白,包括未知基因9個(gè),已知基因1個(gè),未命名蛋白6個(gè),4個(gè)已報(bào)道蛋白,即EtSerpin,Etm094G10,Etm109G06,EtGMP。利用Co-IP的方法驗(yàn)證了EtCDPK4和EtSerpin相互作用關(guān)系,結(jié)果表明EtCDPK4與EtSerpin存在相互作用關(guān)系。
【關(guān)鍵詞】：柔嫩艾美耳球蟲 鈣依賴蛋白激酶4 酶活測(cè)定 入侵 抑制劑 酵母雙雜交
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.7
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-18
• 第一章 文獻(xiàn)綜述18-25
• 1.1 鈣調(diào)素（CaM）18-19
• 1.1.1 鈣調(diào)素的結(jié)構(gòu)和功能18-19
• 1.1.2 鈣調(diào)素在生物體中的分布以及作用機(jī)制19
• 1.1.3 鈣調(diào)素在寄生蟲中所起的作用19
• 1.2 鈣網(wǎng)織蛋白（CRT）19-21
• 1.2.1 鈣網(wǎng)織蛋白的結(jié)構(gòu)和功能19-20
• 1.2.2 鈣網(wǎng)織蛋白在細(xì)胞中的分布以及作用機(jī)制20
• 1.2.3 鈣網(wǎng)織蛋白在寄生蟲中所起的作用20-21
• 1.3 鈣依賴蛋白激酶（CDPKS）21-22
• 1.3.1 鈣依賴蛋白激酶的結(jié)構(gòu)和功能21
• 1.3.2 鈣依賴蛋白激酶在生物體中的分布以及作用機(jī)制21-22
• 1.3.3 鈣依賴蛋白激酶在寄生蟲中所起的作用22
• 1.4 膜聯(lián)蛋白（Annexin）22-23
• 1.4.1 膜聯(lián)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能22-23
• 1.4.2 膜聯(lián)蛋白在生物體中的分布以及作用機(jī)制23
• 1.4.3 膜聯(lián)蛋白在寄生蟲中所起的作用23
• 1.5 展望23-25
• 第二章 柔嫩艾美耳球蟲鈣依賴蛋白激酶4基因的克隆及生物信息學(xué)分析25-48
• 2.1 引言25
• 2.2 材料與方法25-39
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物25-26
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)蟲株26
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)所需主要試劑26
• 2.2.4 主要實(shí)驗(yàn)所需儀器26-27
• 2.2.5 實(shí)驗(yàn)所需試劑配制方法27
• 2.2.6 柔嫩艾美耳球蟲4個(gè)不同發(fā)育階段蟲體的收集與純化27-29
• 2.2.7 柔嫩艾美耳球蟲子孢子總RNA的抽提29-30
• 2.2.8 柔嫩艾美耳球蟲子孢子cDNA末端快速擴(kuò)增法（RACE）模板的制備30-32
• 2.2.9 目的基因cDNA 5’-末端和 3’-末端序列的擴(kuò)增32-35
• 2.2.10 柔嫩艾美耳球蟲鈣依賴蛋白激酶4蛋白基因的生物信息學(xué)分析35
• 2.2.11 反轉(zhuǎn)錄合成與制備柔嫩艾美耳球蟲子孢子階段cDNA模板35
• 2.2.12 柔嫩艾美耳球蟲目的基因EtCDPK4完整開放閱讀框的PCR擴(kuò)增35-36
• 2.2.13 鈣依賴蛋白激酶4在柔嫩艾美耳球蟲4個(gè)不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄水平的差異分析36-39
• 2.3 結(jié)果39-46
• 2.3.1 純化和收集柔嫩艾美耳球蟲不同發(fā)育階段的蟲體39
• 2.3.2 柔嫩艾美耳球蟲蟲體總RNA的提取39-40
• 2.3.3 柔嫩艾美耳球蟲EtCDPK4基因的克隆40-41
• 2.3.4 柔嫩艾美耳球蟲EtCDPK4基因的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和分析41-46
• 2.3.5 柔嫩艾美耳球蟲EtCDPK4在4個(gè)不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平差異分析46
• 2.4 討論46-48
• 第三章 柔嫩艾美耳球蟲鈣依賴蛋白激酶4蛋白表達(dá)及其特性的初步研究48-74
• 3.1 引言48
• 3.2 材料與方法48-62
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物48
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)寄生蟲蟲株、載體和細(xì)胞48
• 3.2.3 實(shí)驗(yàn)所需試劑48-49
• 3.2.4 實(shí)驗(yàn)所需主要儀器設(shè)備49
• 3.2.5 主要實(shí)驗(yàn)所需試劑的配制方法49-51
• 3.2.6 重組表達(dá)系統(tǒng)pColdⅠ-EtCDPK4和pcDNA3.1-FLAG-EtCDPK4構(gòu)建與鑒定51-52
• 3.2.7 重組表達(dá)質(zhì)粒pColdⅠ-EtCDPK4和pcDNA3.1-FLAG-EtCDPK4的表達(dá)52-54
• 3.2.8 原核表達(dá)系統(tǒng)pColdⅠ-EtCDPK4表達(dá)重組蛋白的純化54-55
• 3.2.9 rEtCDPK4重組蛋白多克隆抗體的制備與抗體的純化55-56
• 3.2.10 重組蛋白rEtCDPK4的免疫原性和反應(yīng)原性檢測(cè)分析56-58
• 3.2.11 DF-1 細(xì)胞的復(fù)蘇與傳代培養(yǎng)58
• 3.2.12 EtCDPK4在柔嫩艾美耳球蟲入侵DF-1 不同發(fā)育階段的分布與定位分析58-59
• 3.2.13 間接免疫熒光鑒定重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-FLAG-EtCDPK4在DF-1中的表達(dá)情況59
• 3.2.14 兔抗rEtCDPK4重組蛋白多克隆抗體對(duì)柔嫩艾美耳球蟲子孢子入侵DF-1細(xì)胞的體外抑制分析59-60
• 3.2.15 EtCDPK4基因在柔嫩艾美耳球蟲4個(gè)不同的發(fā)育階段中蛋白質(zhì)翻譯水平的差異分析60-62
• 3.3 結(jié)果62-72
• 3.3.1 EtCDPK4原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建62-63
• 3.3.2 EtCDPK4重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及其蛋白純化63-65
• 3.3.3 兔抗rEtCDPK4多克隆抗體的制備65
• 3.3.4 rEtCDPK4重組蛋白免疫原性和反應(yīng)原性的分析65-67
• 3.3.5 柔嫩艾美耳球蟲蟲體CDPK4天然蛋白的間接免疫熒光定位67-69
• 3.3.6 間接免疫熒光鑒定真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-FLAG-EtCDPK4在DF-1細(xì)胞中的表達(dá)情況69-70
• 3.3.7 兔抗rEtCDPK4多克隆抗體對(duì)柔嫩艾美耳球蟲子孢子入侵DF-1 細(xì)胞的體外抑制實(shí)驗(yàn)70-71
• 3.3.8 柔嫩艾美耳球蟲4個(gè)不同發(fā)育階段中EtCDPK4蛋白翻譯的分析71-72
• 3.4 討論72-74
• 第四章 柔嫩艾美耳球蟲鈣依賴蛋白激酶4催化活性初步研究74-86
• 4.1 引言74
• 4.2 材料與方法74-78
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)寄生蟲蟲株、細(xì)胞74
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)所需試劑74
• 4.2.3 實(shí)驗(yàn)所需主要儀器設(shè)備74-75
• 4.2.4 實(shí)驗(yàn)所需試劑的配制方法75
• 4.2.5 rEtCDPK4重組蛋白酶活性的測(cè)定75-77
• 4.2.6 不同Ca~(2+)濃度對(duì)rEtCDPK4酶催化活性大小的影響77
• 4.2.7 rEtCDPK4特異性抑制劑的篩選和顯著性分析77-78
• 4.2.8 篩選出的rEtCDPK4酶活性抑制劑抑制柔嫩艾美耳球蟲子孢子入侵DF-1細(xì)胞的體外入侵抑制試驗(yàn)78
• 4.3 結(jié)果78-83
• 4.3.1 rEtCDPK4酶活性的測(cè)定78-79
• 4.3.2 不同Ca~(2+)濃度對(duì)rEtCDPK4酶活性大小的影響79-81
• 4.3.3 rEtCDPK4特異性抑制劑的篩選和顯著性分析81-82
• 4.3.4 篩選出的rEtCDPK4酶活性特異性抑制劑抑制子孢子對(duì)DF-1 細(xì)胞入侵試驗(yàn)82-83
• 4.4 討論83-86
• 第五章 柔嫩艾美耳球蟲鈣依賴蛋白激酶4相互作用底物篩選86-105
• 5.1 引言86
• 5.2 材料與方法86-96
• 5.2.1 實(shí)驗(yàn)所需酵母菌株、載體和細(xì)胞86-87
• 5.2.2 酵母雙雜交篩選cDNA文庫(kù)87
• 5.2.3 實(shí)驗(yàn)所需主要試劑87
• 5.2.4 實(shí)驗(yàn)所需主要儀器87
• 5.2.5 實(shí)驗(yàn)所需試劑的配制87-90
• 5.2.6 酵母誘餌Et CDPK4質(zhì)粒的構(gòu)建90
• 5.2.7 酵母菌株Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞的制備90-91
• 5.2.8 BD誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EtCDPK4轉(zhuǎn)化入酵母Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞91-92
• 5.2.9 重組酵母誘餌菌的PCR鑒定92
• 5.2.10 誘餌pGBKT7-EtCDPK4對(duì)Y2HGold酵母菌報(bào)告基因自激活活性的檢測(cè)92
• 5.2.11 誘餌pGBKT7-EtCDPK4對(duì)Y2HGold宿主酵母菌細(xì)胞毒性的檢測(cè)92-93
• 5.2.12 誘餌pGBKT7-EtCDPK4在Y2HGold酵母宿主菌中蛋白表達(dá)情況的檢測(cè)93-94
• 5.2.13 使用誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EtCDPK4靶菌株從柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖子酵母雙雜交cDNA文庫(kù)中篩選相互作用蛋白94-95
• 5.2.14 使用免疫共沉淀（Co-IP）驗(yàn)證其中一個(gè)篩選到的陽(yáng)性克隆EtSerpin95-96
• 5.3 結(jié)果96-102
• 5.3.1 BD誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EtCDPK4的構(gòu)建96-97
• 5.3.2 誘餌重組質(zhì)粒pGBKT7-EtCDPK4轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母菌的PCR鑒定97-98
• 5.3.3 重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EtCDPK4對(duì)Y2HGold酵母菌報(bào)告基因自激活活性的檢測(cè)98
• 5.3.4 重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EtCDPK4對(duì)Y2HGold宿主酵母菌細(xì)胞毒性的檢測(cè)98-99
• 5.3.5 重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EtCDPK4在Y2HGold宿主酵母菌中蛋白表達(dá)情況的檢測(cè)99-100
• 5.3.6 酵母雙雜交篩選到的陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序分析結(jié)果和雜交效率分析100-101
• 5.3.7 Co-IP驗(yàn)證EtCDPK4與陽(yáng)性克隆EtSerpin相互作用關(guān)系101-102
• 5.4 討論102-105
• 第六章 全文總結(jié)105-106
• 參考文獻(xiàn)106-114
• 致謝114-115
• 作者簡(jiǎn)歷115

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本文編號(hào)：804004