本文關(guān)鍵詞：外源基因VEGF在轉(zhuǎn)基因絨山羊中的表達和遺傳穩(wěn)定性研究

  更多相關(guān)文章： 轉(zhuǎn)基因絨山羊 外源基因 拷貝數(shù) 表達 遺傳效率

【摘要】：血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial cell growth factor, VEGF),是一種可以在動物毛囊中表達的毛乳頭細胞自分泌生長因子。研究表明,VEGF基因可以在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生,對于動物毛囊發(fā)育和毛發(fā)生長起重要作用。因此本實驗室選擇VEGF基因作為外源基因?qū)Π柊退拱捉q山羊進行轉(zhuǎn)基因培育,期望獲得高產(chǎn)絨量的轉(zhuǎn)基因絨山羊,并為進一步探索VEGF基因在動物體內(nèi)的作用機理提供實驗依據(jù)。本實驗室近年來通過體細胞克隆技術(shù)獲得的VEGF轉(zhuǎn)基因絨山羊中,有羊絨產(chǎn)量顯著提高和羊絨產(chǎn)量未出現(xiàn)明顯改善的轉(zhuǎn)基因絨山羊,并且成年轉(zhuǎn)基因絨山羊通過有計劃的配種產(chǎn)生了子代羊。本實驗選擇了一只產(chǎn)絨量顯著提高的轉(zhuǎn)基因絨山羊(1號)及其兩只子代(2號、3號)和一只產(chǎn)絨量未見明顯改善的轉(zhuǎn)基因絨山羊(4號)及其兩只子代(5號、6號)進行檢測,并與來自于同一細胞系的體細胞克隆絨山羊(7號)進行對比,確定外源VEGF基因在不同代次轉(zhuǎn)基因絨山羊體內(nèi)的遺傳效率、表達量,為深入探索外源基因在轉(zhuǎn)基因動物中的遺傳規(guī)律提供實驗依據(jù)。本實驗從DNA、RNA、蛋白質(zhì)三個水平對轉(zhuǎn)實驗樣本進行檢測,檢測結(jié)果如下：(1)通過PCR鑒定,1號、2號、3號、4號羊呈轉(zhuǎn)基因陽性。5號、6號羊呈轉(zhuǎn)基因陰性。(2)使用Glucagon基因作為內(nèi)參、絕對定量PCR法對外源VEGF基因拷貝數(shù)進行檢測。得到標準曲線公式：log2N=-0.3879ΔCt+0.3122 (R2=0.9978, p0.001)計算得到各轉(zhuǎn)基因絨山羊的外源基因拷貝數(shù)分別為：1號,1.235；2號,0.977；3號0.962；4號,1.884。1號、2號、3號羊外源基因為單拷貝,4號羊為雙拷貝。(3)以GAPDH基因作為內(nèi)參,使用Real-time-PCR和western blot對外源基因表達量進行檢測。結(jié)果顯示,與7號體細胞克隆羊相比,轉(zhuǎn)基因絨山羊皮膚組織中外源VEGF基因mRNA及蛋白表達量分別是：1號,3.53倍、2.93倍；2號,2.78倍、2.56倍；3號,0.95倍、1.24倍；4號,1.23倍、1.03倍；5號,0.78倍、0.96倍；6號,1.02倍、0.72倍。轉(zhuǎn)基因絨山羊血液中外源VEGF基因mRNA及蛋白表達量分別是：1號,0.57倍、0.98倍；2號,0.78倍、0.87倍；3號,0.69倍、1.12倍；4號,0.32倍、0.94倍；5號,0.91倍、1.12倍；6號,0.89倍、0.83倍。以上結(jié)果顯示,外源VEGF基因在轉(zhuǎn)基因絨山羊中的表達具有皮膚組織特異性,并且部分轉(zhuǎn)基因絨山羊外源基因可以遺傳給下一代轉(zhuǎn)基因絨山羊。外源基因的表達量和遺傳效率與拷貝數(shù)沒有直接關(guān)系。上述實驗結(jié)果為今后深入研究外源基因在轉(zhuǎn)基因動物中的遺傳規(guī)律打下了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：轉(zhuǎn)基因絨山羊 外源基因 拷貝數(shù) 表達 遺傳效率
【學位授予單位】：內(nèi)蒙古大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S827;Q78
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 第一章 文獻綜述12-19
• 1 轉(zhuǎn)基因動物制備的主要方法12-14
• 1.1 顯微注射法12
• 1.2 體細胞核移植12-13
• 1.3 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法13
• 1.4 胚胎干細胞法13
• 1.5 人工酵母染色體(YAC)法13-14
• 1.6 精子載體法14
• 2 外源基因在轉(zhuǎn)基因動物中表達和遺傳的穩(wěn)定性14-17
• 2.1 位置效應(yīng)15
• 2.2 外源基因的表觀遺傳學修飾15-16
• 2.3 外源基因遺傳的穩(wěn)定性16-17
• 3 結(jié)語17-19
• 第二章 VEGF轉(zhuǎn)基因絨山羊陽性鑒定及拷貝數(shù)測定19-35
• 1 實驗材料21-22
• 1.1 實驗儀器21
• 1.2 實驗試劑與耗材21
• 1.3 實驗材料21-22
• 2 實驗方法22-29
• 2.1 PCR轉(zhuǎn)基因陽性鑒定22-25
• 2.1.1 血液基因組DNA提取22-23
• 2.1.2 PCR引物設(shè)計23-24
• 2.1.3 PCR反應(yīng)體系24-25
• 2.1.4 PCR產(chǎn)物電泳25
• 2.1.5 凝膠成像25
• 2.2 絕對定量PCR法檢測轉(zhuǎn)基因絨山羊外源基因拷貝數(shù)25-29
• 2.2.1 絕對定量PCR反應(yīng)標準品制備25-26
• 2.2.2 制作絕對定量PCR標準曲線26
• 2.2.3 質(zhì)粒提取26-27
• 2.2.4 絕對定量PCR引物設(shè)計27
• 2.2.5 實時定量PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序27-29
• 3 實驗結(jié)果29-33
• 3.1 PCR鑒定結(jié)果29-30
• 3.2 絕對定量PCR檢測結(jié)果30-33
• 3.2.1 絕對定量PCR結(jié)果30-32
• 3.2.2 拷貝數(shù)檢測結(jié)果32-33
• 4 討論33-35
• 第三章 VEGF轉(zhuǎn)基因絨山羊外源基因表達量檢測35-49
• 1 實驗材料36-37
• 1.1 主要儀器36
• 1.2 實驗試劑與耗材36
• 1.3 實驗液體配制36-37
• 2 實驗方法37-43
• 2.1 Real-time-PCR檢測皮膚及血液RNA表達量37-40
• 2.1.1 皮膚組織RNA提取37-38
• 2.1.2 血液RNA提取38
• 2.1.3 RT-PCR(reverse transcription PCR)38-39
• 2.1.4 PCR引物設(shè)計39
• 2.1.5 Real-time-PCR反應(yīng)體系39-40
• 2.2 Western blot檢測皮膚及血液VEGF蛋白表達量40-43
• 2.2.1 皮膚組織蛋白質(zhì)的提取40-41
• 2.2.2 血液組織蛋白質(zhì)的提取41
• 2.2.3 Western blot檢測VEGF蛋白表達量41-43
• 3 實驗結(jié)果43-47
• 3.1 Real-time-PCR檢測結(jié)果43-45
• 3.1.1 Real-time-PCR產(chǎn)物特異性檢測43
• 3.1.2 Real-time-PCR檢測皮膚組織mRNA表達量43-44
• 3.1.3 Real-time-PCR檢測血液mRNA表達量44-45
• 3.2 Western blot檢測結(jié)果45-47
• 3.2.1 Western blot檢測皮膚組織蛋白表達量45-46
• 3.2.2 Western blot檢測血液蛋白表達量46-47
• 4 討論47-49
• 結(jié)論49-50
• 參考文獻50-57
• 致謝57

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