本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用qPCR研究中藥對(duì)豬嗜血支原體的體外作用

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【摘要】：研究中藥體外對(duì)M.suis殺滅作用和抑制黏附作用,篩選對(duì)M.suis有殺滅或抑制作用的單味中藥和復(fù)方中藥,為臨床上預(yù)防和治療M.suis感染提供依據(jù)。利用直接鏡檢法和血液直接PCR法篩選出含M.suis的陽性血液和不含M.suis的陰性血液，，制備M.suis陽性紅細(xì)胞、M.suis陰性紅細(xì)胞和M.suis。通過M.suis體外維持培養(yǎng)體系,應(yīng)用qPCR研究不同培養(yǎng)時(shí)間M.suis拷貝數(shù)變化、體外不同藥物對(duì)M.suis拷貝數(shù)影響、體外不同藥物對(duì)M.suis黏附紅細(xì)胞的影響、不同藥物與M.suis或紅細(xì)胞作用后對(duì)M.suis黏附影響和不同濃度藥物與M.suis或紅細(xì)胞作用后對(duì)M.suis黏附影響。結(jié)果顯示：(1)在培養(yǎng)期間M.suis拷貝數(shù)沒有明顯變化。(2)8種單味中丹參、秦皮和甘草的殺滅效果較好,殺滅率分別為33.34%、30.21%和30.15%,青蒿、檳榔、黃芩和苦參殺滅率為25.92%、24.48%、22.58%和22.14%,肉桂皮的殺滅效果最差,殺滅率為0.70%,但單味中藥整體殺滅效果較差;復(fù)方Ⅰ、復(fù)方Ⅱ和復(fù)方Ⅲ的殺滅率分別為48.95%、39.50%和41.04%。(3)8種單味中藥中甘草抑制黏附效果較好,抑制黏附率達(dá)到62.18%,丹參、青蒿、檳榔、苦參、秦皮和黃芩的抑制黏附率分別為34.04%、33.09%、26.19%、25.54%、24.70%、22.77%,肉桂皮的抑制黏附率為0;復(fù)方Ⅰ的抑制黏附率最高可達(dá)82.20%,復(fù)方Ⅱ?yàn)?0.38%,復(fù)方Ⅲ為71.79%。(4)青蒿、黃芩、檳榔、甘草、秦皮、苦參、丹參、復(fù)方Ⅰ、復(fù)方Ⅱ、復(fù)方Ⅲ和強(qiáng)力霉素與M.suis作用后可使紅細(xì)胞上黏附的M.suis拷貝數(shù)減少,其中青蒿、黃芩、檳榔、甘草、復(fù)方Ⅰ和復(fù)方Ⅱ與紅細(xì)胞作用后也可使紅細(xì)胞上黏附的M.suis拷貝數(shù)減少;肉桂皮分別與M.suis或紅細(xì)胞作用后紅細(xì)胞上黏附的M.suis拷貝數(shù)沒有顯著變化。(5)不同濃度的甘草、丹參、青篙、秦皮、復(fù)方Ⅰ、復(fù)方Ⅱ、復(fù)方Ⅲ和強(qiáng)力霉素與M.suis作用后紅細(xì)胞上黏附的M.suis拷貝數(shù)減少,隨著濃度的增加,紅細(xì)胞上黏附的M.suis拷貝數(shù)逐漸減少;甘草、青蒿、復(fù)方Ⅰ和復(fù)方Ⅱ與紅細(xì)胞作用后紅細(xì)胞上黏附的M.suis拷貝數(shù)減少,隨著濃度的增加,紅細(xì)胞上黏附的M.suis拷貝數(shù)逐漸減少。其中秦皮最適濃度為3000μg/mL,其他3種單味中藥和3個(gè)復(fù)方中藥最佳濃度均為4000μg/mL。結(jié)果表明：(1)體外培養(yǎng)的方法無法使M.suis增殖。(2)青蒿、黃芩、檳榔、甘草、秦皮、苦參、丹參、復(fù)方Ⅰ、復(fù)方Ⅱ、復(fù)方Ⅲ和強(qiáng)力霉素可以增強(qiáng)對(duì)M.suis抑制和殺滅作用;青蒿、黃芩、檳榔、甘草、復(fù)方Ⅰ和復(fù)方Ⅱ也可使紅細(xì)胞黏附M.suis的能力減弱;肉桂皮與M.suis或紅細(xì)胞作用后既不能抑制和殺滅M.suis也無法影響紅細(xì)胞黏附M.suis。(3)隨著藥物濃度的增加,甘草、丹參、青蒿、秦皮、復(fù)方1、復(fù)方Ⅱ、復(fù)方Ⅲ和強(qiáng)力霉素對(duì)M.suis抑制和殺滅作用逐漸增強(qiáng),其中甘草、青蒿、復(fù)方Ⅰ和復(fù)方Ⅱ也可使紅細(xì)胞黏附M.suis的能力逐漸減弱。
【關(guān)鍵詞】：豬嗜血支原體 qPCR 體外培養(yǎng) 中藥
【學(xué)位授予單位】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S853.74
【目錄】：

• 摘要9-11
• 前言11-17
• 1 病原體11-12
• 1.1 分類11
• 1.2 形態(tài)結(jié)構(gòu)11-12
• 1.3 理化特性12
• 2 致病過程12-15
• 2.1 黏附12-13
• 2.2 侵入13
• 2.3 營養(yǎng)消耗13
• 2.4 細(xì)胞衰亡13-14
• 2.5 免疫病理14
• 2.6 貧血14-15
• 3 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)15
• 3.1 直接鏡檢法15
• 3.2 清學(xué)方法15
• 3.3 分子生物學(xué)方法15
• 4 體外培養(yǎng)方法15-16
• 5 研究的目的及意義16-17
• 材料與方法17-27
• 1 材料17-19
• 1.1 病料來源17
• 1.2 主要儀器及設(shè)備17
• 1.3 主要試劑及耗材17-18
• 1.4 主要溶液的配制18-19
• 2 方法19-27
• 2.1 中藥培養(yǎng)基的制備19-22
• 2.1.1 中藥的選擇19
• 2.1.2 中藥的熬制19
• 2.1.3 藥物培養(yǎng)基的制備19-22
• 2.2 M.suis檢測(cè)22
• 2.2.1 血液懸滴鏡檢22
• 2.2.2 血液直接PCR22
• 2.3 血液處理22-23
• 2.3.1 M.suis陽性紅細(xì)胞制備22
• 2.3.2 M.suis陰性紅細(xì)胞制備22
• 2.3.3 M.suis制備22-23
• 2.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備23-24
• 2.4.1 重組菌的擴(kuò)增23
• 2.4.2 重組質(zhì)粒DNA的提取23
• 2.4.3 重組質(zhì)粒濃度測(cè)定23-24
• 2.5 M.suis DNA提取24
• 2.6 qPCR方法及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立24-25
• 2.6.1 qPCR方法的建立24
• 2.6.2 qPCR重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立24
• 2.6.3 樣品M.suis DNA qPCR檢測(cè)24-25
• 2.7 體外不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)M.suis拷貝數(shù)影響25
• 2.8 體外不同藥物對(duì)M.suis拷貝數(shù)影響25
• 2.9 體外不同藥物對(duì)M.suis黏附紅細(xì)胞的影響25
• 2.10 不同藥物與M.suis或紅細(xì)胞作用后對(duì)M.suis黏附影響25-26
• 2.10.1 不同藥物與M.suis作用后對(duì)M.suis黏附影響25-26
• 2.10.2 不同藥物與紅細(xì)胞作用后對(duì)M.suis黏附影響26
• 2.11 不同濃度藥物與M.suis或紅細(xì)胞作用后對(duì)M.suis黏附影響26
• 2.11.1 不同濃度藥物與M.suis作用后對(duì)M.suis黏附影響26
• 2.11.2 不同濃度藥物與紅細(xì)胞作用后對(duì)M.suis黏附影響26
• 2.12 數(shù)據(jù)分析26-27
• 結(jié)果27-59
• 1 M.suis的鑒定27-28
• 1.1 血液懸滴鏡檢27
• 1.2 PCR鑒定27-28
• 2 重組質(zhì)粒濃度測(cè)定28
• 3 qPCR重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制28-29
• 4 體外不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)M.suis拷貝數(shù)影響29-30
• 5 體外不同藥物對(duì)M.suis拷貝數(shù)影響30-34
• 5.1 單味中藥對(duì)M.suis拷貝數(shù)影響31-32
• 5.2 復(fù)方中藥對(duì)M.suis拷貝數(shù)影響32-33
• 5.3 藥物對(duì)M.suis的殺滅率33-34
• 6 體外不同藥物對(duì)M.suis黏附紅細(xì)胞的影響34-37
• 6.1 單味中藥對(duì)M.suis黏附紅細(xì)胞的影響34-35
• 6.2 復(fù)方中藥對(duì)M.suis黏附紅細(xì)胞的影響35-36
• 6.3 藥物對(duì)M.suis的抑制黏附率36-37
• 7 不同藥物與M.suis或紅細(xì)胞作用后對(duì)M.suis黏附影響37-42
• 7.1 單味中藥與M.suis作用后對(duì)M.suis黏附影響38-39
• 7.2 復(fù)方中藥與M.suis作用后對(duì)M.suis黏附影響39-40
• 7.3 單味中藥與紅細(xì)胞作用后對(duì)M.suis黏附影響40-41
• 7.4 復(fù)方中藥與紅細(xì)胞作用后對(duì)M.suis黏附影響41-42
• 8 不同濃度藥物與M.suis或紅細(xì)胞作用后對(duì)M.suis黏附影響42-59
• 8.1 不同濃度甘草與M.suis或紅細(xì)胞作用后對(duì)M.suis黏附影響43-45
• 8.1.1 不同濃度甘草與M.suis作用后對(duì)M.suis黏附影響43-44
• 8.1.2 不同濃度甘草與紅細(xì)胞作用后對(duì)M.suis黏附影響44-45
• 8.2 不同濃度丹參與M.suis或紅細(xì)胞作用后對(duì)M.suis黏附影響45-47
• 8.2.1 不同濃度丹參與M.suis作用后對(duì)M.suis黏附影響45-46
• 8.2.2 不同濃度丹參與紅細(xì)胞作用后對(duì)M.suis黏附影響46-47
• 8.3 不同濃度青蒿與M.suis或紅細(xì)胞作用后對(duì)M.suis黏附影響47-49
• 8.3.1 不同濃度青蒿與M.suis作用后對(duì)M.suis黏附影響47-48
• 8.3.2 不同濃度青蒿與紅細(xì)胞作用后對(duì)M.suis黏附影響48-49
• 8.4 不同濃度秦皮與M.suis或紅細(xì)胞作用后對(duì)M.suis黏附影響49-51
• 8.4.1 不同濃度秦皮與M.suis作用后對(duì)M.suis黏附影響49-50
• 8.4.2 不同濃度秦皮與紅細(xì)胞作用后對(duì)M.suis黏附影響50-51
• 8.5 不同濃度復(fù)方Ⅰ與M.suis或紅細(xì)胞后作用對(duì)M.suis黏附影響51-53
• 8.5.1 不同濃度復(fù)方Ⅰ與M.suis作用后對(duì)M.suis黏附影響51-52
• 8.5.2 不同濃度復(fù)方Ⅰ與紅細(xì)胞作用后對(duì)M.suis黏附影響52-53
• 8.6 不同濃度復(fù)方Ⅱ與M.suis或紅細(xì)胞作用后對(duì)M.suis黏附影響53-55
• 8.6.1 不同濃度復(fù)方Ⅱ與M.suis作用后對(duì)M.suis黏附影響53-54
• 8.6.2 不同濃度復(fù)方Ⅱ與紅細(xì)胞作用后對(duì)M.suis黏附影響54-55
• 8.7 不同濃度復(fù)方Ⅲ與M.suis或紅細(xì)胞作用后對(duì)M.suis黏附影響55-57
• 8.7.1 不同濃度復(fù)方Ⅲ與M.suis作用后對(duì)M.suis黏附影響55-56
• 8.7.2 不同濃度復(fù)方Ⅲ與紅細(xì)胞作用后對(duì)M.suis黏附影響56-57
• 8.8 不同濃度強(qiáng)力霉素與M.suis或紅細(xì)胞作用后對(duì)M.suis黏附影響57-59
• 8.8.1 不同濃度強(qiáng)力霉素與M.suis作用后對(duì)M.suis黏附影響57-58
• 8.8.2 不同濃度強(qiáng)力霉素與紅細(xì)胞作用后對(duì)M.suis黏附影響58-59
• 討論59-65
• 1 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)M.suis拷貝數(shù)的影響59
• 2 中藥的選擇59
• 3 M.suis基因組DNA的提取59-60
• 4 qPCR檢測(cè)技術(shù)60
• 5 體外不同藥物對(duì)M.suis拷貝數(shù)影響和體外不同藥物對(duì)M.suis黏附紅細(xì)胞的影響60-61
• 6 單味中藥試驗(yàn)和中藥單體試驗(yàn)結(jié)果的不同61
• 7 去藥處理61
• 8 中藥藥效的分析61-62
• 9 中藥對(duì)M.suis或紅細(xì)胞作用分析62-65
• 結(jié)論65-67
• 參考文獻(xiàn)67-71
• Abstract71-73
• 致謝73

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