發(fā)布時(shí)間：2017-09-01 22:30

  本文關(guān)鍵詞：MiR-223靶向IGF2和ZEB1調(diào)控家禽成肌細(xì)胞的增殖和分化

  更多相關(guān)文章： 家禽成肌細(xì)胞 miR-223 IGF2基因 ZEB1基因 細(xì)胞增殖 細(xì)胞分化

【摘要】：MicroRNA是一種內(nèi)源性小分子非編碼RNA,廣泛存在于真核生物中并參與調(diào)控各類細(xì)胞進(jìn)程。大量研究表明,miRNA參與了雞胚生長發(fā)育、神經(jīng)細(xì)胞和肌肉細(xì)胞的增殖和分化、細(xì)胞遷移、性成熟和免疫應(yīng)答等一系列生命活動(dòng),對(duì)肉雞的生長、發(fā)育和代謝具有重要的調(diào)控作用。本研究在實(shí)驗(yàn)室前期成果的基礎(chǔ)上,篩選出miR-223作為研究肉雞生長性能的候選基因,并以miR-223為切入點(diǎn),一方面探索miR-223在骨骼肌生長發(fā)育中的生物學(xué)功能,另一方面研究miR-223及其靶基因作用于骨骼肌細(xì)胞增殖和分化的分子機(jī)理。論文主要結(jié)果如下:1.通過qRT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)miR-223在雞胚肌肉發(fā)育過程中呈先上升后下降的趨勢(shì),其中,在肌肉快速發(fā)育的12E-17E高表達(dá),說明miR-223參與雞胚的肌肉發(fā)育。2.通過成肌細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-223在成肌細(xì)胞分化過程中持續(xù)極顯著上升(P0.01),說明miR-223可能對(duì)成肌細(xì)胞的分化具有重要調(diào)控功能。3.通過流式細(xì)胞術(shù)、CCK-8和qRT-PCR檢測(cè)過表達(dá)和干擾miR-223的成肌細(xì)胞,結(jié)果表明:miR-223在成肌細(xì)胞中具有抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞分化的功能。4.利用生物信息學(xué)分析和參考文獻(xiàn)報(bào)道,預(yù)測(cè)與細(xì)胞增殖分化相關(guān)的IGF2基因和ZEB1基因?yàn)閙iR-223的靶基因,并通過雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)、qRT-PCR和western blot等試驗(yàn),確定miR-223能夠靶向抑制IGF2和ZEB1基因的表達(dá)。5.過表達(dá)和干擾IGF2的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),IGF2基因能夠促進(jìn)家禽成肌細(xì)胞的增殖、分裂和分化過程(P0.01);干擾ZEB1基因能夠促進(jìn)家禽成肌細(xì)胞的分化(P0.01)。本研究由上述結(jié)果得出結(jié)論:gga-miR-223靶向IGF2抑制成肌細(xì)胞的增殖,靶向ZEB1促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化。本論文揭示了miR-223在家禽骨骼肌生長發(fā)育中的功能和調(diào)控機(jī)制,為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)miR-223在細(xì)胞增殖、分化和其他生物學(xué)進(jìn)程中的作用提供了依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：家禽成肌細(xì)胞 miR-223 IGF2基因 ZEB1基因 細(xì)胞增殖 細(xì)胞分化
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S83
【目錄】：

• 摘要2-3
• Abstract3-10
• 1 前言10-15
• 1.1 MiRNA的簡(jiǎn)介10
• 1.2 MiRNA在肉雞生長過程中發(fā)揮的作用10-12
• 1.3 MiR-223的研究進(jìn)展12-13
• 1.4 MiR-223潛在靶基因IGF2和ZEB1的研究進(jìn)展13-15
• 1.5 研究目的和意義15
• 2 材料與方法15-36
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料15-18
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞15-16
• 2.1.2 主要試劑和配制16
• 2.1.3 分子克隆實(shí)驗(yàn)需要的試劑及配制16-17
• 2.1.4 細(xì)胞培養(yǎng)需要的試劑及配制17
• 2.1.5 Western blot所需試劑及配制17-18
• 2.1.6 主要儀器及設(shè)備18
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法18-36
• 2.2.1 雞胚肌肉組織采樣18
• 2.2.2 組織DNA的抽提18-19
• 2.2.3 雞胚的性別鑒定19
• 2.2.4 RNA抽提及檢測(cè)19-20
• 2.2.5 qRT-PCR檢測(cè)miR-223在雞胚肌肉發(fā)育過程中的表達(dá)變化20-22
• 2.2.5.1 MiRNA的反轉(zhuǎn)錄20-21
• 2.2.5.2 MiRNA的qPCR21
• 2.2.5.3 qPCR的數(shù)據(jù)分析處理21-22
• 2.2.6 原代成肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定22-23
• 2.2.6.1 原代成肌細(xì)胞的分離22
• 2.2.6.2 原代成肌細(xì)胞的培養(yǎng)22
• 2.2.6.3 原代成肌細(xì)胞的傳代培養(yǎng)22
• 2.2.6.4 原代成肌細(xì)胞的免疫熒光鑒定22-23
• 2.2.7 鵪鶉成肌細(xì)胞系QM-7 的培養(yǎng)23
• 2.2.8 qPCR檢測(cè)成肌細(xì)胞增殖分化過程中miR-223的表達(dá)變化23-24
• 2.2.9 MiR-223細(xì)胞生物學(xué)功能檢測(cè)24-27
• 2.2.9.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24
• 2.2.9.2 成肌細(xì)胞的細(xì)胞周期檢測(cè)24-25
• 2.2.9.3 CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞增殖情況25
• 2.2.9.4 qPCR檢測(cè)肌肉分化的標(biāo)記基因25-27
• 2.2.10 MiR-223的靶標(biāo)驗(yàn)證27-31
• 2.2.10.1 靶基因的預(yù)測(cè)27
• 2.2.10.2 雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建27-30
• 2.2.10.3 雙熒光素酶報(bào)告載體的轉(zhuǎn)染30-31
• 2.2.10.4 雙熒光素酶活性檢測(cè)31
• 2.2.11 qRT-PCR檢測(cè)miR-223對(duì)靶基因mRNA水平的影響31-32
• 2.2.12 Western Blot驗(yàn)證miR-223對(duì)靶基因蛋白水平的影響32-33
• 2.2.12.1 Western Blot樣品的自備32
• 2.2.12.2 樣品總蛋白定量32
• 2.2.12.3 Western Blot基本步驟32-33
• 2.2.13靶基因調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化的驗(yàn)證33-36
• 2.2.13.1 IGF2過表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定33-34
• 2.2.13.2 IGF2過表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染及檢測(cè)34
• 2.2.13.3 IGF2和ZEB1基因干擾片段的合成34-35
• 2.2.13.4 siRNA干擾效率的檢測(cè)35
• 2.2.13.5 轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)細(xì)胞增殖分化的影響35-36
• 3 結(jié)果和分析36-54
• 3.1 MiR-223在雞胚發(fā)育過程中的表達(dá)規(guī)律36-37
• 3.1.1 雞胚性別鑒定結(jié)果36
• 3.1.2 肌肉組織總RNA抽提結(jié)果36-37
• 3.1.3 MiR-223在雞胚肌肉組織發(fā)育過程中的表達(dá)變化37
• 3.2 成肌細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化前后miR-223的表達(dá)變化37-40
• 3.2.1 雞胚成肌細(xì)胞的分離和鑒定37-38
• 3.2.2 成肌細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)分化38-39
• 3.2.3 qPCR檢測(cè)成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化前后miR-223的表達(dá)39-40
• 3.3 MiR-223在成肌細(xì)胞中的生物學(xué)功能40-44
• 3.3.1 過表達(dá)和干擾miR-223的化學(xué)合成片段的轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)40
• 3.3.2 MiR-223抑制成肌細(xì)胞增殖40-41
• 3.3.3 MiR-223阻滯成肌細(xì)胞的細(xì)胞周期41-42
• 3.3.4 MiR-223促進(jìn)成肌細(xì)胞分化42-44
• 3.3.4.1 MiR-223促進(jìn)成肌細(xì)胞分化標(biāo)記基因的表達(dá)42-43
• 3.3.4.2 MiR-223促進(jìn)肌管的形成43-44
• 3.4 MiR-223的靶標(biāo)驗(yàn)證44-48
• 3.4.1 野生型和突變型靶基因 3’UTR的雙熒光素酶報(bào)告載體44-45
• 3.4.2 雙熒光素酶活性的檢測(cè)45-46
• 3.4.3 MiR-223與IGF2的靶標(biāo)效應(yīng)46-47
• 3.4.4 MiR-223與ZEB1的靶標(biāo)效應(yīng)47-48
• 3.5 IGF2促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖和分化48-52
• 3.5.1 IGF2過表達(dá)載體和siRNA的準(zhǔn)備48-49
• 3.5.2 IGF2促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖49-51
• 3.5.3 IGF2促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化51-52
• 3.6 ZEB1抑制成肌細(xì)胞的分化52-54
• 3.6.1 siRNA干擾ZEB1基因的檢測(cè)52
• 3.6.2 ZEB1基因?qū)Τ杉〖?xì)胞增殖的作用52-53
• 3.6.3 ZEB1抑制肌肉分化標(biāo)記基因的表達(dá)53-54
• 4 討論54-59
• 4.1 MiR-223在雞胚發(fā)育中的表達(dá)規(guī)律54-55
• 4.2 MiR-223的生物學(xué)意義55-57
• 4.2.1 MiR-223對(duì)成肌細(xì)胞增殖的作用效果55-56
• 4.2.2 MiR-223對(duì)成肌細(xì)胞分化的作用效果56-57
• 4.2.3 MiR-223對(duì)家禽成肌細(xì)胞增殖分化的調(diào)控方式57
• 4.3 IGF2與骨骼肌發(fā)育57-58
• 4.4 ZEB1與骨骼肌發(fā)育58-59
• 5 結(jié)論59-61
• 致謝61-63
• 參考文獻(xiàn)63-71

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 殷丹丹;孔榮;劉志軍;張二寶;德偉;;miR-223促進(jìn)人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的研究[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2013年20期

2 歐陽偉;王永山;王永強(qiáng);王笑梅;朱向東;畢振威;范紅結(jié);;傳染性法氏囊病病毒感染細(xì)胞內(nèi)源性microRNA表達(dá)差異分析[J];中國獸醫(yī)學(xué)報(bào);2012年03期

3 許紫薇;朱形好;方一鳴;張林;任啟平;;miRNA調(diào)控小鼠涎腺發(fā)育基因及相關(guān)性研究[J];口腔醫(yī)學(xué)研究;2012年01期

4 劉小友;徐健;;Micro-RNA-223參與腎移植后急性排斥反應(yīng)中的作用[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2011年10期

5 王衛(wèi)衛(wèi);劉建強(qiáng);黃浩杰;鄒多武;李兆申;高軍;;miR-223在胰腺癌組織中的表達(dá)及意義[J];醫(yī)學(xué)研究雜志;2011年06期

6 周懷軍;;miRNAs在禽流感病毒感染家禽中的調(diào)控作用[J];中國家禽;2010年11期

7 王嘉力;賈存靈;蘇利紅;魏澤輝;;家雞CHD1基因PCR快速性別鑒定方法的建立及其在早期雞胚中的應(yīng)用[J];家禽科學(xué);2009年12期

8 梅文燕,丁小燕;脊椎動(dòng)物胚胎骨骼肌的生成[J];生命科學(xué);1999年01期

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本文編號(hào)：774800