發(fā)布時間：2017-08-31 16:30

  本文關(guān)鍵詞：亮氨酸、組氨酸、賴氨酸和蛋氨酸對奶牛乳腺上皮細(xì)胞中酪蛋白合成的影響及調(diào)控機(jī)理研究

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【摘要】：乳蛋白是乳的重要的營養(yǎng)組成成分,必需氨基酸(essential amino acid,EAA)不僅可以作為乳蛋白合成的前體物之一,還可以通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路中的蛋白調(diào)節(jié)乳蛋白合成,提高乳含量和品質(zhì)。本研究以永生化奶牛乳腺上皮細(xì)胞(immortalized bovine mammary epithelial cell line,CMEC-H)為模型,首先分別單一添加亮氨酸(Leucine,Leu)和組氨酸(Histidine,His)從細(xì)胞增殖水平,mRNA轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平探究這兩種EAA通過mTOR信號通路調(diào)控酪蛋白(casein)合成的分子機(jī)理。在此基礎(chǔ)上探討了組氨酸(Histidine,His)、賴氨酸(Lysine,Lys),亮氨酸(Leucine,Leu)和蛋氨酸(Methionine,Met)的最佳配比,且闡明在此最佳配比模式下研究這四種EAA通過mTOR信號通路調(diào)控β-casein合成的分子機(jī)理。主要研究結(jié)果如下:試驗一:本研究以體外培養(yǎng)的CMEC-H細(xì)胞為模型,研究單一添加Leu對casein的合成及相關(guān)信號通路的影響。以厄爾平衡溶液(EBSS)代替培養(yǎng)基,并設(shè)其為陰性對照,在此溶液基礎(chǔ)上單一添加不同濃度的Leu,利用噻唑藍(lán)比色法(MTT)法探討添加不同濃度梯度的Leu水平以及培養(yǎng)時間(12 h和24 h)對CMEC-H細(xì)胞增殖的影響;同時運(yùn)用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印跡(WB)檢測casein和mTOR信號路徑元件因子的表達(dá)。MTT結(jié)果表明:與陰性對照組相比,添加0.15~5.40 mmol/L Leu時,CMEC-H細(xì)胞數(shù)量增加,且添加不同時間(12 h和24 h)CMEC-H細(xì)胞增殖趨勢一致;qRT-PCR的結(jié)果表明:與陰性對照組相比,當(dāng)添加0.45~10.8 mmol/L Leu 6 h時,αs1-casein(CSN1S1)、αS2-casein(CSN1S2)和κ-casein(CSN3)基因表達(dá)均顯著上調(diào)(P0.05)。當(dāng)Leu濃度為1.35mmol/L時,mTOR信號通路相關(guān)基因mTOR、m TOR調(diào)控蛋白(raptor)、mTOR復(fù)合物1中的綁定蛋白(GβL)、信號下游因子真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(4EBP1)和真核細(xì)胞翻譯延伸因子2(eEF2)基因表達(dá)量最高。而核糖體S6蛋白激酶(S6K1)基因的表達(dá)量隨著Leu濃度的增加而減少。WB的結(jié)果表明:與陰性對照相比,casein和P-mTOR(Ser2481)、P-raptor(Ser792)、P-eIF4E(Ser209)、P-eEF2(Thr56)隨著Leu濃度的增加(0.45 to 10.8 mmol/L)而增加(P0.01),而Leu的濃度在1.35到10.8 mmol/L,P-S6K1(Thr389)隨Leu濃度的增加而增加;當(dāng)Leu濃度為10.8mmol/l時,p-4ebp1(thr37)和gβl表達(dá)量會被抑制。當(dāng)leu濃度為5.4~10.8mmol/l時,p-rps6(ser235/236)隨leu濃度的增加而減少。線性回歸模型分析結(jié)果顯示,當(dāng)添加leu時,αs1-casein的表達(dá)與p-mtor(ser2481)、p-s6k1(thr389)和p-eef2(thr56)成顯著的正相關(guān)(p0.01)。綜上所述,在乳腺上皮細(xì)胞中,leu能通過mtor信號通路促進(jìn)酪蛋白合成相關(guān)因子的表達(dá)。試驗二:本研究以體外培養(yǎng)的cmec-h細(xì)胞為模型,研究單一添加his對casein的合成及相關(guān)信號通路的影響。本研究以ebss溶液代替培養(yǎng)基,并設(shè)其為陰性對照,在此溶液基礎(chǔ)上單一添加不同濃度的his,利用mtt法探討添加不同濃度梯度的his添加水平以及培養(yǎng)時間(12h和24h)對cmec-h增殖的影響;同時運(yùn)用qrt-pcr和wb檢測casein和mtor信號路徑元件因子表達(dá)。mtt的結(jié)果表明:與陰性對照組相比,添加0.15~9.60mmol/lhis時,cmec-h細(xì)胞數(shù)量增加,且添加不同時間(12h和24h)細(xì)胞增殖趨勢一致;qrt-pcr的結(jié)果表明:當(dāng)添加0.15~4.8mmol/lhis6h時,csn1s1、csn2和csn3基因表達(dá)均顯著上調(diào)(p0.05)。當(dāng)his的濃度為0.15~9.6mmol/l時,4ebp1、eef2、真核翻譯起始因子4e(eif4e)和核糖體蛋白s6(rps6)基因的表達(dá)量隨著his濃度的增加而增加,而mtor基因的表達(dá)量隨著his濃度的增加而減少。當(dāng)his的濃度為4.80mmol/l時,gβl基因的表達(dá)量最高;當(dāng)his的濃度為1.20mmol/l時,s6k1基因表達(dá)量最高。wb結(jié)果表明,與陰性對照相比,當(dāng)his濃度為0.15~9.6mmol/l時,αs2-casein、β-casein和κ-casein的表達(dá)量和p-mtor(ser2481)、p-raptor(ser792)、p-s6k1(thr389)、p-4ebp1(thr37)、p-eif4e(ser209)、p-eef2(thr56)的磷酸化隨著his濃度的增加而增加(p0.01)。線性回歸模型分析結(jié)果顯示,當(dāng)添加his時,β-casein(p0.01)和κ-casein(p0.01)與p-eef2的磷酸化成正相關(guān)。綜上所述,在乳腺上皮細(xì)胞中,his能通過mtor信號通路促進(jìn)酪蛋白合成相關(guān)因子的表達(dá)。試驗三:奶牛日糧中不同eaa的配比對于提高乳蛋白產(chǎn)量十分重要。β-casein是一種具有高營養(yǎng)價值的乳蛋白。然而,在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中,eaa的最優(yōu)濃度配比對β-casein表達(dá)的影響的研究并不多。本研究以cmec-h細(xì)胞為模型,利用響應(yīng)面中心復(fù)合設(shè)計(acentralcompositeexperimentaldesign,ccd)探究his,lys,met和leu這四種eaa的最優(yōu)濃度配比,且闡明這四種eaa是通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mechanistictargetofrapamycincomplex1,mtorc1)信號通路調(diào)控β-casein的表達(dá)。以特殊培養(yǎng)基(不含所有AA)為陰性對照,運(yùn)用WB的方法檢測CCD的28組配比試驗中,每一組β-casein的表達(dá)和mTORC1信號通路中相關(guān)蛋白磷酸化的變化。響應(yīng)面結(jié)果表明:這四種EAA顯著影響β-casein的表達(dá)(P0.01,R2=0.71)。其中當(dāng)His:Lys:Met:Leu=5:6:1:7時,β-casein的表達(dá)量最高。只有Leu和Met在合成β-casein時存在負(fù)相關(guān)交互作用(P0.01)。進(jìn)一步試驗結(jié)果表明無論是單獨添加這四種EAA還是添加最優(yōu)濃度配比的EAA都會增加P-mTOR(Ser2481)、P-Raptor(Ser792)、P-S6K1(Thr389)、P-RPS6(Ser235/236)和P-eEF2(Thr56)的磷酸化。然而,當(dāng)單獨添加Lys、Met和Leu會抑制P-4EBP1(Thr37)的磷酸化。單獨添加Met,會抑制P-eIF2α(Ser51)的磷酸化。當(dāng)添加最優(yōu)的濃度配比的混合EAA時,β-casein的表達(dá)量高達(dá)陽性對照(培養(yǎng)基中含有所有氨基酸)的98%。
【關(guān)鍵詞】：組氨酸 賴氨酸 蛋氨酸 亮氨酸 mTOR 酪蛋白
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S823.5
【目錄】：

• 摘要4-7
• SUMMARY7-10
• 英文縮略圖表10-16
• 第一章 緒論16-28
• 1.1 研究背景16-17
• 1.2 乳蛋白的成分和功能17-18
• 1.3 乳蛋白合成機(jī)理18-19
• 1.3.1 乳蛋白的來源18
• 1.3.2 乳腺細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成18-19
• 1.4 乳腺中氨基酸的營養(yǎng)代謝19-21
• 1.4.1 乳腺中氨基酸的供給和攝取19-20
• 1.4.2 乳腺中氨基酸的代謝20-21
• 1.5 理想蛋白質(zhì)模型及氨基酸平衡理論的提出21-22
• 1.6 氨基酸影響乳蛋白合成的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路22-25
• 1.6.1 m TOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路22-24
• 1.6.2 EAA通過mTOR信號通路調(diào)控乳蛋白的合成24-25
• 1.7 永生化奶牛乳腺上皮細(xì)胞的系的應(yīng)用及構(gòu)建25-26
• 1.8 立題依據(jù)26
• 1.9 研究目的和意義26-27
• 1.10技術(shù)路線27-28
• 第二章 亮氨酸通過mTOR信號通路影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞中酪蛋白的合成28-50
• 2.1. 引言28
• 2.2. 試驗材料和方法28-38
• 2.2.1 主要儀器28-29
• 2.2.2 樣品的準(zhǔn)備29
• 2.2.3 奶牛乳腺上皮永生系細(xì)胞的培養(yǎng)29-30
• 2.2.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖30-31
• 2.2.5 qRT-RCR檢測相關(guān)基因表達(dá)與分析31-35
• 2.2.6 Western Blot檢測35-38
• 2.3 結(jié)果與分析38-48
• 2.3.1 亮氨酸對CMEC-H細(xì)胞增殖的影響38-39
• 2.3.2 亮氨酸在CMEC-H細(xì)胞中對酪蛋白合成的影響39-41
• 2.3.3 亮氨酸在CMEC-H細(xì)胞中對mTORC1表達(dá)的影響41-43
• 2.3.4 亮氨酸在CMEC-H細(xì)胞中對mTOR信號通路相關(guān)因子表達(dá)的影響43-46
• 2.3.5 在CMEC-H細(xì)胞中添加亮氨酸探究對酪蛋白的表達(dá)與mTOR信號通路相關(guān)蛋白磷酸化的相關(guān)性46-48
• 2.4 討論48-49
• 2.4.1 亮氨酸對CMEC-H細(xì)胞增殖的影響48
• 2.4.2 亮氨酸對m TOR信號通路介導(dǎo)酪蛋白合成表達(dá)的影響48-49
• 2.4.3 亮氨酸對m TORC1信號通路相關(guān)因子表達(dá)的影響49
• 2.5 結(jié)論49-50
• 第三章 組氨酸通過mTOR信號通路影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞中酪蛋白的合成50-66
• 3.1. 引言50
• 3.2. 試驗材料和方法50-53
• 3.2.1 主要儀器50
• 3.2.2 樣品的準(zhǔn)備50
• 3.2.3 奶牛乳腺上皮永生系細(xì)胞的培養(yǎng)50
• 3.2.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖50-51
• 3.2.5 qRT-RCR檢測相關(guān)基因表達(dá)與分析51-52
• 3.2.6 Western Blot檢測52-53
• 3.3 結(jié)果與分析53-63
• 3.3.1 組氨酸對CMEC-H細(xì)胞增殖的影響53-54
• 3.3.2 組氨酸對CMEC-H細(xì)胞中酪蛋白相關(guān)因子表達(dá)的影響54-57
• 3.3.3 組氨酸對m TORC1相關(guān)因子表達(dá)的影響57-58
• 3.3.4 組氨酸在CMEC-H細(xì)胞中對mTOR信號通路相關(guān)因子表達(dá)的影響58-61
• 3.3.5 在CMEC-H細(xì)胞中添加組氨酸探究對酪蛋白的表達(dá)與mTOR信號通路相關(guān)蛋白磷酸化的相關(guān)性61-63
• 3.4 討論63-64
• 3.4.1 組氨酸對CMEC-H細(xì)胞增殖的影響63-64
• 3.4.2 組氨酸對m TOR信號通路介導(dǎo)酪蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)的影響64
• 3.4.3 組氨酸對m TORC1信號通路相關(guān)因子表達(dá)的影響64
• 3.5 結(jié)論64-66
• 第四章 組，，賴，蛋和亮氨酸最優(yōu)配比模式通過mTOR信號通路調(diào)節(jié)乳腺上皮細(xì)胞中β -酪蛋白的表達(dá)66-84
• 4.1 引言66-67
• 4.2. 試驗材料和方法67-72
• 4.2.1 主要儀器67
• 4.2.2 樣品的準(zhǔn)備67
• 4.2.3 奶牛乳腺上皮永生系細(xì)胞的培養(yǎng)67
• 4.2.4 試驗一：MTT法檢測細(xì)胞增殖67-68
• 4.2.5 Western Blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)與分析68-72
• 4.3 結(jié)果與分析72-81
• 4.3.1 不同EAA對CMEC-H細(xì)胞增殖的影響72-73
• 4.3.2 單獨添加亮、組、賴和蛋氨酸對 β-casein表達(dá)的影響73-74
• 4.3.3 利用響應(yīng)面設(shè)計篩選 β-casein酪蛋白表達(dá)的最佳濃度配比模式74-79
• 4.3.4 最佳濃度配比EAA對 β-casein表達(dá)的影響79
• 4.3.5 亮、組、賴和蛋氨酸最佳濃度配比對m TORC1相關(guān)蛋白表達(dá)的影響6479-80
• 4.3.6 亮、組、賴和蛋氨酸最佳濃度配比對m TOR下游相關(guān)蛋白表達(dá)的影響80-81
• 4.4 討論81-83
• 4.4.1 組、賴、蛋和亮氨酸對CMEC-H細(xì)胞增殖的影響81-82
• 4.4.2 組、賴、蛋和亮氨酸對CMEC-H中 β-酪蛋白合成的影響82
• 4.4.3 組、賴、蛋和亮氨酸對CMEC-H中mTORC1信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響82-83
• 4.5 結(jié)論83-84
• 第五章 全文總結(jié)84-85
• 參考文獻(xiàn)85-92
• 致謝92-93
• 作者簡歷93-95
• 導(dǎo)師簡介95-96

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王月影;朱河水;王艷玲;;乳腺上皮細(xì)胞的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)研究進(jìn)展[J];江西農(nóng)業(yè)學(xué)報;2008年06期

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3 吳媛媛;李鍵;楊櫟;畢琳;田甜;;牦牛乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)的研究[J];西南民族大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2009年04期

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5 李吉霞;葛秀國;王文秀;張涌;;牛乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2012年07期

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7 郝明超;劉r

本文編號：766672