本文關(guān)鍵詞：PEDV部分N基因的原核表達(dá)和間接ELISA方法的建立

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【摘要】：豬流行性腹瀉病毒(PEDV)可引起新生仔豬急性腹瀉、嘔吐、脫水和高死亡率。該病毒首次出現(xiàn)在1977年的英國(guó)和1978年的比利時(shí)。在過(guò)去的30年里,PEDV感染已經(jīng)在歐洲和亞洲的養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。尤其在2013-2014年,PEDV在美國(guó)大面積爆發(fā),并傳播到美國(guó)北方的其他國(guó)家包括加拿大和墨西哥等。在美國(guó),從2013年開(kāi)始,僅一年的時(shí)間已經(jīng)造成總豬量10%以上的經(jīng)濟(jì)損失,總計(jì)約七百萬(wàn)仔豬死亡。為了研究豬流行性腹瀉病毒(PEDV)部分N蛋白的原核表達(dá)產(chǎn)物是否具有抗原性,并為建立PEDV的間接ELISA方法奠定基礎(chǔ)。本試驗(yàn)應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增N基因的部分核酸序列,經(jīng)克隆后將目的片段連接到原核表達(dá)載體pET-30a(+)中,成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-30a-PEDV-N-450,重組菌于37℃、0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE分析并進(jìn)行Western blotting鑒定。結(jié)果表明,構(gòu)建的原核表達(dá)重組質(zhì)粒測(cè)序正確,且該蛋白與抗血清(PEDV高免血清)具有良好的反應(yīng)活性。本試驗(yàn)已成功構(gòu)建的PEDV部分N蛋白基因表達(dá)載體,該研究為后續(xù)豬流行性腹瀉病毒感染的血清學(xué)診斷方法的建立提供依據(jù)。為了建立豬流行性腹瀉病毒抗體檢測(cè)的間接ELISA方法,本研究以純化的原核表達(dá)的豬流行性腹瀉病毒部分N基因的重組蛋白作為包被抗原,建立了豬流行性腹瀉病毒抗體檢測(cè)的間接ELISA方法,將該方法命名為rnPED-ELISA。該抗原不與其它常見(jiàn)的七種豬病的陽(yáng)性血清發(fā)生交叉反應(yīng),批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于13%;rnPED-ELISA相對(duì)于SN試驗(yàn)的敏感性為93.33%、特異性為90.00%;rnTGE-ELISA與TSZ公司的全病毒抗體檢測(cè)試劑盒的符合率達(dá)91.67%。采用rnPED-ELISA方法檢測(cè)200份臨床樣品,PEDV抗體陽(yáng)性檢出率為83.5%。本試驗(yàn)建立的rnPED-ELISA方法具有良好的敏感性和特異性,可以為免疫豬群抗體監(jiān)測(cè)和PED流行病學(xué)調(diào)查提供一種快速、簡(jiǎn)便的血清學(xué)診斷方法。
【關(guān)鍵詞】：豬流行性腹瀉病毒 N基因片段 原核表達(dá) 間接ELISA
【學(xué)位授予單位】：天津農(nóng)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要11-12
• Abstract12-13
• 第一章 引言13-26
• 1.1 病原學(xué)13-16
• 1.1.1 分類13-14
• 1.1.2 結(jié)構(gòu)和基因組14-16
• 1.1.3 生物學(xué)和物理化學(xué)性質(zhì)16
• 1.1.4 病毒分離培養(yǎng)16
• 1.2 流行病學(xué)16-18
• 1.2.1 世界流行情況16-17
• 1.2.2 美國(guó)流行情況17-18
• 1.2.3 傳播18
• 1.3 發(fā)病機(jī)制18-20
• 1.3.1 組織嗜性18-19
• 1.3.2 病毒腸道復(fù)制19
• 1.3.3 病理生理學(xué)19
• 1.3.4 抵抗PED的年齡因素19
• 1.3.5 急性病毒血癥19-20
• 1.3.6 免疫應(yīng)答20
• 1.3.7 病毒衰減20
• 1.4 流行性PED與地方性PED20-21
• 1.4.1 流行性PED20-21
• 1.4.2 地方性PED和細(xì)菌病毒共感染21
• 1.5 病變21-22
• 1.5.1 眼觀病變21-22
• 1.5.2 組織學(xué)病變22
• 1.6 免疫預(yù)防22-23
• 1.6.1 流行病PED22
• 1.6.2 地方性PED22-23
• 1.7 診斷23
• 1.8 疫苗23-24
• 1.9 治療24-25
• 1.10 總結(jié)25
• 1.11 本研究的特色25-26
• 第二章 PEDV部分N基因的原核表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的反應(yīng)原性分析26-50
• 2.1 試驗(yàn)材料26-29
• 2.1.1 病毒26
• 2.1.2 菌株26
• 2.1.3 載體26
• 2.1.4 RNA提取及PCR主要試劑26
• 2.1.5 工具酶26-27
• 2.1.6 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)27
• 2.1.7 試劑盒27
• 2.1.8 蛋白印跡轉(zhuǎn)移膜27
• 2.1.9 溶液27-28
• 2.1.10 主要儀器28-29
• 2.2 試驗(yàn)方法29-42
• 2.2.1 PEDV N-450基因合成29-32
• 2.2.2 構(gòu)建克隆載體PMDTM18-T-N450DH5α32-36
• 2.2.3 表達(dá)載體構(gòu)建36-39
• 2.2.4 表達(dá)載體在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)39-41
• 2.2.5 蛋白純化工藝研究41-42
• 2.2.6 Western blotting分析42
• 2.3 試驗(yàn)結(jié)果42-48
• 2.3.1 N-450基因PCR42
• 2.3.2 克隆載體的構(gòu)建42-44
• 2.3.3 表達(dá)載體的構(gòu)建44-45
• 2.3.4 重組表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)45-46
• 2.3.5 重組表達(dá)載體的可溶性鑒定46-47
• 2.3.6 表達(dá)蛋白的純化47-48
• 2.3.7 Western blotting檢測(cè)48
• 2.4 討論48-50
• 2.4.1 目的基因的選擇48-49
• 2.4.2 感受態(tài)細(xì)胞的選擇49
• 2.4.3 誘導(dǎo)條件優(yōu)化49
• 2.4.4 染料選擇49-50
• 第三章 PEDV流行株部分N基因重組蛋白的間接ELISA方法建立50-60
• 3.1 材料50
• 3.2 方法50-54
• 3.2.1 測(cè)定蛋白濃度50-51
• 3.2.2 洗脫液透析濃縮51
• 3.2.3 間接ELISA方法的建立51-53
• 3.2.4 rnPED-ELISA性能評(píng)價(jià)53-54
• 3.3 結(jié)果54-57
• 3.3.1 蛋白濃度測(cè)定結(jié)果54
• 3.3.2 重組N蛋白的定量分析54
• 3.3.3 rnPED-ELISA試驗(yàn)條件摸索54-56
• 3.3.4 SN試驗(yàn)相關(guān)性分析56
• 3.3.5 與商品化試劑盒比較56-57
• 3.3.6 流行病學(xué)調(diào)查57
• 3.4 討論57-60
• 3.4.1 ELISA工作條件的確定58
• 3.4.2 抗原的純度對(duì)ELISA的影響58
• 3.4.3 臨床檢測(cè)結(jié)果58-60
• 第四章 結(jié)論60-61
• 參考文獻(xiàn)61-70
• 附錄70-71
• 致謝71-72
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文的目錄72

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 張博;李守軍;呂茂杰;楊保收;;豬流行性腹瀉病毒部分N基因的原核表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物反應(yīng)原性分析[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2016年03期

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本文編號(hào)：764780