發(fā)布時間：2017-08-31 09:26

  本文關鍵詞：PEDV部分N基因的原核表達和間接ELISA方法的建立

  更多相關文章： 豬流行性腹瀉病毒 N基因片段 原核表達 間接ELISA

【摘要】：豬流行性腹瀉病毒(PEDV)可引起新生仔豬急性腹瀉、嘔吐、脫水和高死亡率。該病毒首次出現在1977年的英國和1978年的比利時。在過去的30年里,PEDV感染已經在歐洲和亞洲的養(yǎng)殖業(yè)產生了巨大的經濟損失。尤其在2013-2014年,PEDV在美國大面積爆發(fā),并傳播到美國北方的其他國家包括加拿大和墨西哥等。在美國,從2013年開始,僅一年的時間已經造成總豬量10%以上的經濟損失,總計約七百萬仔豬死亡。為了研究豬流行性腹瀉病毒(PEDV)部分N蛋白的原核表達產物是否具有抗原性,并為建立PEDV的間接ELISA方法奠定基礎。本試驗應用RT-PCR技術擴增N基因的部分核酸序列,經克隆后將目的片段連接到原核表達載體pET-30a(+)中,成功構建了重組質粒pET-30a-PEDV-N-450,重組菌于37℃、0.5 mmol/L IPTG誘導表達后進行SDS-PAGE分析并進行Western blotting鑒定。結果表明,構建的原核表達重組質粒測序正確,且該蛋白與抗血清(PEDV高免血清)具有良好的反應活性。本試驗已成功構建的PEDV部分N蛋白基因表達載體,該研究為后續(xù)豬流行性腹瀉病毒感染的血清學診斷方法的建立提供依據。為了建立豬流行性腹瀉病毒抗體檢測的間接ELISA方法,本研究以純化的原核表達的豬流行性腹瀉病毒部分N基因的重組蛋白作為包被抗原,建立了豬流行性腹瀉病毒抗體檢測的間接ELISA方法,將該方法命名為rnPED-ELISA。該抗原不與其它常見的七種豬病的陽性血清發(fā)生交叉反應,批內和批間重復性試驗的變異系數均小于13%;rnPED-ELISA相對于SN試驗的敏感性為93.33%、特異性為90.00%;rnTGE-ELISA與TSZ公司的全病毒抗體檢測試劑盒的符合率達91.67%。采用rnPED-ELISA方法檢測200份臨床樣品,PEDV抗體陽性檢出率為83.5%。本試驗建立的rnPED-ELISA方法具有良好的敏感性和特異性,可以為免疫豬群抗體監(jiān)測和PED流行病學調查提供一種快速、簡便的血清學診斷方法。
【關鍵詞】：豬流行性腹瀉病毒 N基因片段 原核表達 間接ELISA
【學位授予單位】：天津農學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要11-12
• Abstract12-13
• 第一章 引言13-26
• 1.1 病原學13-16
• 1.1.1 分類13-14
• 1.1.2 結構和基因組14-16
• 1.1.3 生物學和物理化學性質16
• 1.1.4 病毒分離培養(yǎng)16
• 1.2 流行病學16-18
• 1.2.1 世界流行情況16-17
• 1.2.2 美國流行情況17-18
• 1.2.3 傳播18
• 1.3 發(fā)病機制18-20
• 1.3.1 組織嗜性18-19
• 1.3.2 病毒腸道復制19
• 1.3.3 病理生理學19
• 1.3.4 抵抗PED的年齡因素19
• 1.3.5 急性病毒血癥19-20
• 1.3.6 免疫應答20
• 1.3.7 病毒衰減20
• 1.4 流行性PED與地方性PED20-21
• 1.4.1 流行性PED20-21
• 1.4.2 地方性PED和細菌病毒共感染21
• 1.5 病變21-22
• 1.5.1 眼觀病變21-22
• 1.5.2 組織學病變22
• 1.6 免疫預防22-23
• 1.6.1 流行病PED22
• 1.6.2 地方性PED22-23
• 1.7 診斷23
• 1.8 疫苗23-24
• 1.9 治療24-25
• 1.10 總結25
• 1.11 本研究的特色25-26
• 第二章 PEDV部分N基因的原核表達及表達產物的反應原性分析26-50
• 2.1 試驗材料26-29
• 2.1.1 病毒26
• 2.1.2 菌株26
• 2.1.3 載體26
• 2.1.4 RNA提取及PCR主要試劑26
• 2.1.5 工具酶26-27
• 2.1.6 蛋白質分子量標準27
• 2.1.7 試劑盒27
• 2.1.8 蛋白印跡轉移膜27
• 2.1.9 溶液27-28
• 2.1.10 主要儀器28-29
• 2.2 試驗方法29-42
• 2.2.1 PEDV N-450基因合成29-32
• 2.2.2 構建克隆載體PMDTM18-T-N450DH5α32-36
• 2.2.3 表達載體構建36-39
• 2.2.4 表達載體在大腸桿菌中誘導表達39-41
• 2.2.5 蛋白純化工藝研究41-42
• 2.2.6 Western blotting分析42
• 2.3 試驗結果42-48
• 2.3.1 N-450基因PCR42
• 2.3.2 克隆載體的構建42-44
• 2.3.3 表達載體的構建44-45
• 2.3.4 重組表達載體的誘導表達45-46
• 2.3.5 重組表達載體的可溶性鑒定46-47
• 2.3.6 表達蛋白的純化47-48
• 2.3.7 Western blotting檢測48
• 2.4 討論48-50
• 2.4.1 目的基因的選擇48-49
• 2.4.2 感受態(tài)細胞的選擇49
• 2.4.3 誘導條件優(yōu)化49
• 2.4.4 染料選擇49-50
• 第三章 PEDV流行株部分N基因重組蛋白的間接ELISA方法建立50-60
• 3.1 材料50
• 3.2 方法50-54
• 3.2.1 測定蛋白濃度50-51
• 3.2.2 洗脫液透析濃縮51
• 3.2.3 間接ELISA方法的建立51-53
• 3.2.4 rnPED-ELISA性能評價53-54
• 3.3 結果54-57
• 3.3.1 蛋白濃度測定結果54
• 3.3.2 重組N蛋白的定量分析54
• 3.3.3 rnPED-ELISA試驗條件摸索54-56
• 3.3.4 SN試驗相關性分析56
• 3.3.5 與商品化試劑盒比較56-57
• 3.3.6 流行病學調查57
• 3.4 討論57-60
• 3.4.1 ELISA工作條件的確定58
• 3.4.2 抗原的純度對ELISA的影響58
• 3.4.3 臨床檢測結果58-60
• 第四章 結論60-61
• 參考文獻61-70
• 附錄70-71
• 致謝71-72
• 攻讀學位期間發(fā)表論文的目錄72

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前5條

1 張博;李守軍;呂茂杰;楊保收;;豬流行性腹瀉病毒部分N基因的原核表達及表達產物反應原性分析[J];中國畜牧獸醫(yī);2016年03期

2 朱迪國;宋建德;袁麗萍;魏榮;;2013—2014年全球豬流行性腹瀉重大疫情分析[J];中國動物檢疫;2014年10期

3 石達;陳建飛;時洪艷;張志榜;馮力;;豬流行性腹瀉病毒N蛋白與Vero E6核仁蛋白Fibrillarin的亞細胞定位分析[J];中國預防獸醫(yī)學報;2011年11期

4 張志榜;陳建飛;時洪艷;陳小金;馮力;;豬流行性腹瀉病毒CH/S株M蛋白全長的原核表達及其反應原性分析[J];中國獸醫(yī)科學;2011年01期

5 孫東波;馮力;時洪艷;陳建飛;;豬流行性腹瀉病毒分子生物學研究進展[J];動物醫(yī)學進展;2006年10期

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本文編號：764780