本文關(guān)鍵詞：內(nèi)蒙古中部地區(qū)羊源腸球菌臨床株耐藥性與毒力基因的檢測

  更多相關(guān)文章： 羊腸球菌 雙重PCR 耐藥性 毒力基因 EfaA原核表達(dá)

【摘要】：腸球菌是人和動物腸道內(nèi)的正常菌群,過去被認(rèn)為不會引發(fā)致病,但在近年來的研究中發(fā)現(xiàn)腸球菌可使人和動物致病,且腸球菌屬感染已成為醫(yī)院內(nèi)感染疾病的第三位。自2013年7月至2014年11月,本實(shí)驗(yàn)從內(nèi)蒙古中部地區(qū)羊場發(fā)生以神經(jīng)癥狀為主要特征的腦組織多次分離到球菌,經(jīng)過進(jìn)一步鑒定后確認(rèn)該分離菌株為腸球菌。由于屎腸球菌的分離比例較高,為進(jìn)一步在臨床上對此病原菌進(jìn)行快速診斷,本研究開展了腸球菌與屎腸球菌的雙重PCR試驗(yàn),建立了雙重PCR的試驗(yàn)條件和方法。試驗(yàn)將內(nèi)蒙古中部地區(qū)分離到的羊源腸球菌菌株,結(jié)合本地區(qū)常用的抗生素藥物,包括氟苯尼考、氧氟沙星、紅霉素、恩諾沙星、萬古霉素、土霉素、利福平、氨芐西林、鏈霉素,慶大霉素10種藥物,利用微量肉湯稀釋法,觀察確定臨床分離菌株的耐藥性并測定其最小抑菌濃度(MIC值)。并用PCR方法對臨床分離菌株的耐藥基因進(jìn)行檢測,PCR試驗(yàn)結(jié)果表明：內(nèi)蒙古中部地區(qū)羊源腸球菌具有氨基糖苷類耐藥基因、紅霉素耐藥基因與四環(huán)素耐藥基因。藥物敏感性檢測表明,臨床分離菌株對土霉素、利福平、氨芐西林表現(xiàn)出明顯的耐藥性。對恩諾沙星、萬古霉素、氧氟沙星較為敏感。有相關(guān)研究表明腸球菌屬的耐藥性多與其毒力基因相關(guān),因此本試驗(yàn)檢測了分離菌株的毒力基因,同時本研究為初步探索屎腸球菌心內(nèi)膜炎抗原基因(EfaA)調(diào)控的蛋白功能,對屎腸球菌的毒力基因EfaA(心內(nèi)膜炎抗原)進(jìn)行了原核表達(dá)。試驗(yàn)結(jié)果表明：臨床分離菌株檢測到了cyl、Ace、GelE、EfaA、 AS、Esp毒力基因。經(jīng)Western-blot方法檢測,本試驗(yàn)成功表達(dá)出EfaA毒力基因。
【關(guān)鍵詞】：羊腸球菌 雙重PCR 耐藥性 毒力基因 EfaA原核表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.26
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-10
• 縮略語表10-11
• 1 引言11-16
• 1.1 腸球菌屬的生物特性11
• 1.2 腸球菌的分型11
• 1.3 腸球菌的致病性研究11-12
• 1.4 腸球菌的毒力基因12-13
• 1.4.1 細(xì)胞溶解素(cyl)12
• 1.4.2 表面蛋白(Esp)12
• 1.4.3 聚類物質(zhì)(AS)12-13
• 1.4.4 蛋白明膠酶E(GelE)13
• 1.4.5 膠原蛋白粘附素(Ace)13
• 1.4.6 心內(nèi)膜炎基因抗原(EfaA)13
• 1.5 腸球菌的耐藥性13-14
• 1.6 腸球菌對萬古霉素耐藥性研究14
• 1.7 腸球菌耐藥性與毒力基因的相關(guān)性研究14-16
• 2 腸球菌的分離、鑒定與同源性分析16-24
• 2.1 材料16-17
• 2.1.1 病料的來源16
• 2.1.2 主要儀器與設(shè)備16
• 2.1.3 生物學(xué)試劑16-17
• 2.1.4 試驗(yàn)動物17
• 2.2 試驗(yàn)方法17-20
• 2.2.1 試驗(yàn)方法設(shè)計方案17
• 2.2.2 菌株的培養(yǎng)與純化17
• 2.2.3 分離菌株的鑒定17-20
• 2.2.4 臨床分離菌株對小白鼠的致病性試驗(yàn)20
• 2.3 結(jié)果與分析20-23
• 2.3.1 菌株菌落特征及革蘭氏染色結(jié)果20
• 2.3.2 生化試驗(yàn)結(jié)果20-21
• 2.3.3 16s-rRNA PCR試驗(yàn)測序鑒定結(jié)果21-23
• 2.3.4 動物試驗(yàn)結(jié)果23
• 2.4 討論23-24
• 3 羊源腸球菌屬與屎腸球菌雙重PCR方法的建立24-31
• 3.1 材料24
• 3.1.1 試驗(yàn)菌株24
• 3.1.2 主要儀器及試劑24
• 3.2 方法24-26
• 3.2.1 引物設(shè)計24
• 3.2.2 細(xì)菌基因組DNA的提取24
• 3.2.3 雙重PCR擴(kuò)增24-25
• 3.2.4 雙重PCR特異性試驗(yàn)25
• 3.2.5 雙重PCR的敏感性試驗(yàn)25
• 3.2.6 雙重PCR方法的驗(yàn)證25-26
• 3.3 結(jié)果與分析26-29
• 3.3.1 單對引物特異性驗(yàn)證及雙重PCR反應(yīng)結(jié)果26
• 3.3.2 雙重PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果26-27
• 3.3.3 雙重PCR反應(yīng)敏感性試驗(yàn)結(jié)果27-28
• 3.3.4 模擬感染樣品的特異性試驗(yàn)結(jié)果28-29
• 3.4 討論29-31
• 4 臨床分離菌株耐藥性及耐藥基因的檢測31-37
• 4.1 材料31-32
• 4.1.1 試驗(yàn)菌株31
• 4.1.2 主要試劑31
• 4.1.3 試驗(yàn)所用藥物31-32
• 4.2 方法32-34
• 4.2.1 試驗(yàn)所用藥物的配制方法32-33
• 4.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)33
• 4.2.3 細(xì)菌的耐藥性檢測方法33
• 4.2.4 細(xì)菌總DNA的組提取33-34
• 4.2.5 耐藥基因檢測34
• 4.3 結(jié)果及分析34-36
• 4.3.1 細(xì)菌耐藥性檢測結(jié)果34
• 4.3.2 耐藥基因試驗(yàn)結(jié)果34-36
• 4.4 討論36-37
• 5 羊源屎腸球菌毒力基因的檢測及心內(nèi)膜炎基因EFAA基因原核表達(dá)37-51
• 5.1 材料37
• 5.1.1 試驗(yàn)所用表達(dá)載體37
• 5.1.2 試驗(yàn)所用試劑37
• 5.2 方法37-43
• 5.2.1 主要溶液的配置方法38
• 5.2.2 提取臨床分離菌株的總DNA38
• 5.2.3 臨床分離菌株毒力基因的檢測38-39
• 5.2.4 EfaA毒力基因的純化39
• 5.2.5 EfaA毒力基因克隆與檢測39-40
• 5.2.6 EfaA毒力基因克隆質(zhì)粒提取40
• 5.2.7 空質(zhì)粒的制備40
• 5.2.8 PCR方法鑒定提取質(zhì)粒的正確表達(dá)方向40
• 5.2.9 EfaA毒力基因表達(dá)的檢測雙酶切試驗(yàn)40-41
• 5.2.10 IPTG誘導(dǎo)試驗(yàn)41-42
• 5.2.11 Western blot檢測42-43
• 5.2.12 抗體反應(yīng)和顯色反應(yīng)43
• 5.3 試驗(yàn)結(jié)果43-49
• 5.3.1 羊源屎腸球菌毒力基因的檢測結(jié)果43
• 5.3.2 膠原蛋白黏附素(Ace)毒力基因檢測結(jié)果43
• 5.3.3 細(xì)胞溶解素(cyl)檢測結(jié)果43-44
• 5.3.4 蛋白明膠酶E(GelE)檢測結(jié)果44
• 5.3.5 心內(nèi)膜炎抗原基因(EfaA)檢測結(jié)果44-45
• 5.3.6 聚集物質(zhì)基因(AS)檢測結(jié)果45-46
• 5.3.7 表面蛋白基因(Esp)檢測結(jié)果46
• 5.3.8 ATCC 51299毒力基因檢測結(jié)果46-47
• 5.3.9 EfaA測序結(jié)果47
• 5.3.10 雙酶切試驗(yàn)結(jié)果47-48
• 5.3.11 IPTG誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果48
• 5.3.12 Western Blot檢測結(jié)果48-49
• 5.4 討論49-51
• 6 全文結(jié)論51-52
• 致謝52-53
• 參考文獻(xiàn)53-58
• 作者簡介58

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