本文關鍵詞：在煙草中表達豬輪狀病毒VP7蛋白的研究

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【摘要】：近年來,植物疫苗的開發(fā)利用已經成為研究熱點,因其具有安全、有效、成本低廉的優(yōu)勢,逐步得到科學界的認同。豬輪狀病毒(PRV)是引起豬病毒性腹瀉的主要病原微生物之一,是目前危害我國養(yǎng)豬業(yè)的一種主要病毒。VP7蛋白是輪狀病毒(RV)粒子表面的外殼蛋白,也是RV主要的中和抗原,可以引起機體產生中和抗體,起到免疫保護作用。VP4和VP6蛋白分別是RV的外殼蛋白和內殼蛋白,都是重要的保護性抗原,在預防RV感染時,可與VP7一同刺激機體產生免疫效應。本研究通過構建高效植物表達載體,建立在煙草中表達VP7、VP4和VP6蛋白的遺傳轉化體系,為開發(fā)植物源PRV疫苗奠定基礎。試驗主要取得如下結果:(1)根據PRV VP7的氨基酸序列,選取能產生中和反應的51-312位氨基酸,用煙草偏愛密碼子進行優(yōu)化人工合成基因序列。在目的基因上游添加Ω序列以增強翻譯,下游添加M細胞靶向肽-Col序列增強免疫效應,并添加內質網滯留信號ER序列定向表達蛋白,融合6個His標簽用于蛋白的分離純化。(2)成功構建了pBI121-VP7植物表達載體,通過凍融法轉入農桿菌EHA105菌株中。利用農桿菌介導的注射侵染法將VP7基因轉入本氏煙草中,經RT-PCR檢測、SDS-PAGE及用His-Tag抗體進行Western Blotting分析,初步檢測到VP7蛋白的表達。(3)用農桿菌EHA105介導的葉盤法將VP7基因轉入普通煙草,經共培養(yǎng)、篩選、分化及生根過程最終得到2株轉基因幼苗,通過煙草葉片直接PCR的方法進行鑒定,但未檢測到目標條帶,還需進一步驗證VP7基因是否穩(wěn)定轉化。(4)設計并優(yōu)化合成了PRV的VP4與VP7融合基因VP4-7以及VP6基因,成功構建了pBI121-VP4-7、pBI121-VP6植物表達載體,為后續(xù)在煙草中表達VP4-VP7融合蛋白、VP6蛋白及研發(fā)二價或二聯(lián)植物疫苗奠定基礎。
【關鍵詞】：豬輪狀病毒 VP7基因 植物疫苗 瞬時表達 穩(wěn)定的遺傳轉化
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S859.797;Q943.2
【目錄】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-10
• 第一章 文獻綜述10-18
• 1.1 豬輪狀病毒PRV研究進展10-11
• 1.1.1 豬輪狀病毒PRV概述10
• 1.1.2 PRV的三種主要抗原10-11
• 1.2 植物生物反應器的研究11-14
• 1.2.1 植物生物反應器特點11
• 1.2.2 植物轉基因技術方法-農桿菌介導的植物轉化11-13
• 1.2.3 植物生物反應器國內外研究現(xiàn)狀13-14
• 1.3 RV轉基因植物疫苗的研究14-15
• 1.4 植物疫苗研究問題分析15-16
• 1.5 免疫佐劑增強免疫原性和保護作用16
• 1.6 本研究的目的與意義16-17
• 1.7 試驗技術路線17-18
• 第二章 豬輪狀病毒VP7基因在煙草中的瞬時表達18-36
• 2.1 材料18-19
• 2.1.1 試驗材料18
• 2.1.2 試驗儀器18
• 2.1.3 主要試劑及配方18-19
• 2.2 試驗方法19-28
• 2.2.1 VP7基因的設計及合成19-20
• 2.2.2 VP7基因植物表達載體的構建20-22
• 2.2.3 pBI121-VP7質粒轉化農桿菌22-23
• 2.2.4 煙草的培養(yǎng)與瞬時轉化23-24
• 2.2.5 轉基因煙草轉錄水平的檢測24-26
• 2.2.6 煙草總可溶性蛋白的提取26
• 2.2.7 SDS-PAGE、Western Blotting分析26-28
• 2.3 結果與分析28-34
• 2.3.1 VP7基因的優(yōu)化合成28-29
• 2.3.2 VP7基因植物表達載體的構建29-31
• 2.3.3 pBI121-VP7重組質粒轉化農桿菌的鑒定31-32
• 2.3.4 煙草的培養(yǎng)與瞬時轉化32
• 2.3.5 轉基因煙草轉錄水平的檢測32-33
• 2.3.6 煙草蛋白粗提液的SDS-PAGE分析33-34
• 2.3.7 煙草粗提液的Western Blotting分析34
• 2.4 討論34-35
• 2.5 小結35-36
• 第三章 豬輪狀病毒VP7基因在煙草中的穩(wěn)定轉化36-41
• 3.1 試驗材料36-37
• 3.1.1 植物材料、目的基因和菌種36
• 3.1.2 主要試驗儀器和試劑36-37
• 3.2 試驗方法37-38
• 3.2.1 農桿菌葉盤法轉化煙草37
• 3.2.2 轉基因煙草的初步鑒定37-38
• 3.3 結果與分析38-39
• 3.3.1 農桿菌葉盤法轉化煙草38-39
• 3.3.2 轉基因煙草的初步鑒定39
• 3.4 討論39-40
• 3.5 小結40-41
• 第四章 VP4-7 與VP6基因植物表達載體的構建41-49
• 4.1 材料41
• 4.1.1 目的基因、菌種和載體41
• 4.1.2 主要試驗儀器和試劑41
• 4.2 試驗方法41-43
• 4.2.1 VP4-7、VP6基因的設計41-42
• 4.2.2 VP4-7、VP6基因植物表達載體的構建42-43
• 4.3 結果與分析43-48
• 4.3.1 VP4-7 基因的合成43-44
• 4.3.2 VP6基因的合成44-45
• 4.3.3 VP4-7、VP6基因植物表達載體的構建45-48
• 4.4 小結48-49
• 第五章 結論與展望49-50
• 5.1 結論49
• 5.2 創(chuàng)新點49
• 5.3 展望49-50
• 參考文獻50-54
• 附錄54-56
• 致謝56-57
• 作者簡介57

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