本文關(guān)鍵詞：在煙草中表達(dá)豬輪狀病毒VP7蛋白的研究

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【摘要】：近年來(lái),植物疫苗的開(kāi)發(fā)利用已經(jīng)成為研究熱點(diǎn),因其具有安全、有效、成本低廉的優(yōu)勢(shì),逐步得到科學(xué)界的認(rèn)同。豬輪狀病毒(PRV)是引起豬病毒性腹瀉的主要病原微生物之一,是目前危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的一種主要病毒。VP7蛋白是輪狀病毒(RV)粒子表面的外殼蛋白,也是RV主要的中和抗原,可以引起機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,起到免疫保護(hù)作用。VP4和VP6蛋白分別是RV的外殼蛋白和內(nèi)殼蛋白,都是重要的保護(hù)性抗原,在預(yù)防RV感染時(shí),可與VP7一同刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫效應(yīng)。本研究通過(guò)構(gòu)建高效植物表達(dá)載體,建立在煙草中表達(dá)VP7、VP4和VP6蛋白的遺傳轉(zhuǎn)化體系,為開(kāi)發(fā)植物源PRV疫苗奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)主要取得如下結(jié)果:(1)根據(jù)PRV VP7的氨基酸序列,選取能產(chǎn)生中和反應(yīng)的51-312位氨基酸,用煙草偏愛(ài)密碼子進(jìn)行優(yōu)化人工合成基因序列。在目的基因上游添加Ω序列以增強(qiáng)翻譯,下游添加M細(xì)胞靶向肽-Col序列增強(qiáng)免疫效應(yīng),并添加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)ER序列定向表達(dá)蛋白,融合6個(gè)His標(biāo)簽用于蛋白的分離純化。(2)成功構(gòu)建了pBI121-VP7植物表達(dá)載體,通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105菌株中。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的注射侵染法將VP7基因轉(zhuǎn)入本氏煙草中,經(jīng)RT-PCR檢測(cè)、SDS-PAGE及用His-Tag抗體進(jìn)行Western Blotting分析,初步檢測(cè)到VP7蛋白的表達(dá)。(3)用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的葉盤(pán)法將VP7基因轉(zhuǎn)入普通煙草,經(jīng)共培養(yǎng)、篩選、分化及生根過(guò)程最終得到2株轉(zhuǎn)基因幼苗,通過(guò)煙草葉片直接PCR的方法進(jìn)行鑒定,但未檢測(cè)到目標(biāo)條帶,還需進(jìn)一步驗(yàn)證VP7基因是否穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。(4)設(shè)計(jì)并優(yōu)化合成了PRV的VP4與VP7融合基因VP4-7以及VP6基因,成功構(gòu)建了pBI121-VP4-7、pBI121-VP6植物表達(dá)載體,為后續(xù)在煙草中表達(dá)VP4-VP7融合蛋白、VP6蛋白及研發(fā)二價(jià)或二聯(lián)植物疫苗奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：豬輪狀病毒 VP7基因 植物疫苗 瞬時(shí)表達(dá) 穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S859.797;Q943.2
【目錄】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-10
• 第一章 文獻(xiàn)綜述10-18
• 1.1 豬輪狀病毒PRV研究進(jìn)展10-11
• 1.1.1 豬輪狀病毒PRV概述10
• 1.1.2 PRV的三種主要抗原10-11
• 1.2 植物生物反應(yīng)器的研究11-14
• 1.2.1 植物生物反應(yīng)器特點(diǎn)11
• 1.2.2 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)方法-農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化11-13
• 1.2.3 植物生物反應(yīng)器國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀13-14
• 1.3 RV轉(zhuǎn)基因植物疫苗的研究14-15
• 1.4 植物疫苗研究問(wèn)題分析15-16
• 1.5 免疫佐劑增強(qiáng)免疫原性和保護(hù)作用16
• 1.6 本研究的目的與意義16-17
• 1.7 試驗(yàn)技術(shù)路線17-18
• 第二章 豬輪狀病毒VP7基因在煙草中的瞬時(shí)表達(dá)18-36
• 2.1 材料18-19
• 2.1.1 試驗(yàn)材料18
• 2.1.2 試驗(yàn)儀器18
• 2.1.3 主要試劑及配方18-19
• 2.2 試驗(yàn)方法19-28
• 2.2.1 VP7基因的設(shè)計(jì)及合成19-20
• 2.2.2 VP7基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建20-22
• 2.2.3 pBI121-VP7質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌22-23
• 2.2.4 煙草的培養(yǎng)與瞬時(shí)轉(zhuǎn)化23-24
• 2.2.5 轉(zhuǎn)基因煙草轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)24-26
• 2.2.6 煙草總可溶性蛋白的提取26
• 2.2.7 SDS-PAGE、Western Blotting分析26-28
• 2.3 結(jié)果與分析28-34
• 2.3.1 VP7基因的優(yōu)化合成28-29
• 2.3.2 VP7基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建29-31
• 2.3.3 pBI121-VP7重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的鑒定31-32
• 2.3.4 煙草的培養(yǎng)與瞬時(shí)轉(zhuǎn)化32
• 2.3.5 轉(zhuǎn)基因煙草轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)32-33
• 2.3.6 煙草蛋白粗提液的SDS-PAGE分析33-34
• 2.3.7 煙草粗提液的Western Blotting分析34
• 2.4 討論34-35
• 2.5 小結(jié)35-36
• 第三章 豬輪狀病毒VP7基因在煙草中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化36-41
• 3.1 試驗(yàn)材料36-37
• 3.1.1 植物材料、目的基因和菌種36
• 3.1.2 主要試驗(yàn)儀器和試劑36-37
• 3.2 試驗(yàn)方法37-38
• 3.2.1 農(nóng)桿菌葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草37
• 3.2.2 轉(zhuǎn)基因煙草的初步鑒定37-38
• 3.3 結(jié)果與分析38-39
• 3.3.1 農(nóng)桿菌葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草38-39
• 3.3.2 轉(zhuǎn)基因煙草的初步鑒定39
• 3.4 討論39-40
• 3.5 小結(jié)40-41
• 第四章 VP4-7 與VP6基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建41-49
• 4.1 材料41
• 4.1.1 目的基因、菌種和載體41
• 4.1.2 主要試驗(yàn)儀器和試劑41
• 4.2 試驗(yàn)方法41-43
• 4.2.1 VP4-7、VP6基因的設(shè)計(jì)41-42
• 4.2.2 VP4-7、VP6基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建42-43
• 4.3 結(jié)果與分析43-48
• 4.3.1 VP4-7 基因的合成43-44
• 4.3.2 VP6基因的合成44-45
• 4.3.3 VP4-7、VP6基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建45-48
• 4.4 小結(jié)48-49
• 第五章 結(jié)論與展望49-50
• 5.1 結(jié)論49
• 5.2 創(chuàng)新點(diǎn)49
• 5.3 展望49-50
• 參考文獻(xiàn)50-54
• 附錄54-56
• 致謝56-57
• 作者簡(jiǎn)介57

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