本文關(guān)鍵詞：鴨FTH1基因啟動(dòng)子區(qū)克隆及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析

  更多相關(guān)文章： 鴨 FTH1基因 啟動(dòng)子 分子克隆 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

【摘要】：大量研究證實(shí)鐵蛋白(FTH1)表達(dá)變化與肝炎密切相關(guān)。本課題組前期通過(guò)抑制性消減雜交技術(shù)也發(fā)現(xiàn),FTH1為雛鴨肝炎病毒侵染過(guò)程中表達(dá)下調(diào)的關(guān)鍵候選基因,對(duì)FTH1基因編碼區(qū)進(jìn)行了測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)該基因的編碼區(qū)在雛鴨肝炎病毒(DHV-1)感染發(fā)病、未發(fā)病和對(duì)照組不同個(gè)體間僅發(fā)現(xiàn)有一處同義突變,其余未發(fā)生任何有義突變、缺失或重排。為了進(jìn)一步揭示鴨FTH1基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制,本研究主要開(kāi)展了如下工作：1.運(yùn)用基因組步移擴(kuò)增,成功獲得了duFTH1基因ATG上游-1110 bp,并通過(guò)在線預(yù)測(cè)5'側(cè)翼序列含有一個(gè)典型的CpG島,同時(shí)還發(fā)現(xiàn)duFTH1基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近存在Sp-1等多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)反式作用元件,且這些反式作用元件還位于CG二核苷酸位點(diǎn)上。BSP檢測(cè)結(jié)果顯示,鴨血液、脾臟組織中duFTH1基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島處于低甲基化狀態(tài),且發(fā)現(xiàn)DHV-1病毒感染后發(fā)病、未發(fā)病和對(duì)照組血液duFTH1基因的甲基化程度均處于低甲基化狀態(tài)。2.通過(guò)制備一系列啟動(dòng)子缺失突變體：pGL3-Basic-M1(+145～-765)、pGL3-Basic-M2 (+145～486)、pGL3-Basic-M3(+145～-265)、GL3-Basic-M4(+145～-144)、pGL3-Basic-M5 (+145～-35)、pGL3-Basic-M6(+145～-11)和pGL3-Basic-M7(+145～+50),雙熒光素酶報(bào)告基因顯示在表達(dá)載體pGL3-M4和pGL3-M5(-144 bp/-35 bp)之間存在重要的作用元件,對(duì)啟動(dòng)子活性具有影響。對(duì)DHV-1病毒感染后發(fā)病、未發(fā)病組duFTH1基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性區(qū)(-144 bp/-35 bp)序列進(jìn)行了SNP篩查,發(fā)現(xiàn)在DHV-1不同處理組間僅存在1處堿基突變(-54 CT),alibaba2和jaspar軟件在線預(yù)測(cè)該突變位點(diǎn)還影響到轉(zhuǎn)錄因子NRF1結(jié)合。3.為證實(shí)該SNP位點(diǎn)(-54 CT)的作用機(jī)制,對(duì)duFTH1基因核心啟動(dòng)子區(qū)可能存在的轉(zhuǎn)錄因子NRF1結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了定點(diǎn)突變,雙熒光素酶報(bào)告基因顯示：突變重組質(zhì)粒(-54 T)熒光素酶活性極顯著高于未突變重組質(zhì)粒(-54 C)(P0.01)。為進(jìn)一步驗(yàn)證該位點(diǎn)的作用,繼續(xù)開(kāi)展了凝膠電泳阻滯遷移分析(EMSA),結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)錄因子NRF1與duFTH1基因啟動(dòng)子區(qū)序列能夠結(jié)合,而位點(diǎn)-54 CT突變明顯減弱了結(jié)合條帶,競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)及超凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)更進(jìn)一步證實(shí)了結(jié)合的特異性。由上可知,duFTH1基因轉(zhuǎn)錄不受其啟動(dòng)子區(qū)甲基修飾調(diào)控,而受核心啟動(dòng)子區(qū)-144bp/-35 bp內(nèi)的-54 CT突變影響。
【關(guān)鍵詞】：鴨 FTH1基因 啟動(dòng)子 分子克隆 轉(zhuǎn)錄調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q78;S834
【目錄】：

• 中文摘要3-4
• ABSTRACT4-8
• 符號(hào)說(shuō)明8-9
• 第一章 文獻(xiàn)綜述9-17
• 1 FTH1的結(jié)構(gòu)與功能9-12
• 1.1 FTH1的結(jié)構(gòu)概述9-10
• 1.2 FTH1的抗氧化應(yīng)激功能10-11
• 1.3 FTH1的免疫防御功能11-12
• 2 FTH1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究12-14
• 2.1 真核生物啟動(dòng)子的順式作用元件與反式作用因子12-13
• 2.2 FTH1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究進(jìn)展13-14
• 3 FTH1基因的表觀遺傳調(diào)控14-16
• 3.1 真核生物的表觀遺傳修飾14-15
• 3.2 FTH1基因表觀遺傳修飾研究進(jìn)展15-16
• 4 本研究的目的和意義16-17
• 第二章 鴨FTH1基因啟動(dòng)子區(qū)克隆與DNA甲基化分析17-27
• 1 材料與方法17-23
• 1.1 材料與試劑17-18
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物17
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑17-18
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器18
• 1.2 方法18-23
• 1.2.1 基因組步移PCR擴(kuò)增及測(cè)序18-20
• 1.2.2 序列分析20-21
• 1.2.3 甲基化分析21-23
• 2 結(jié)果與分析23-25
• 2.1 基因組步移PCR擴(kuò)增與克隆測(cè)序23
• 2.2 鴨FTH1基因5'側(cè)翼CpG島預(yù)測(cè)23-24
• 2.3 鴨FTH1基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)結(jié)果24-25
• 3 討論25-27
• 第三章 鴨FTH1基因啟動(dòng)子調(diào)控活性分析與轉(zhuǎn)錄因子鑒定27-46
• 1 材料與方法27-38
• 1.1 材料與試劑27-28
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料27
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑27-28
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器28
• 1.2 方法28-38
• 1.2.1 啟動(dòng)子系列缺失表達(dá)載體的構(gòu)建28-30
• 1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染30
• 1.2.3 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的檢測(cè)30-31
• 1.2.4 定點(diǎn)突變表達(dá)載體的構(gòu)建與活性檢測(cè)31-32
• 1.2.5 鴨FTH1基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性區(qū)SNP檢測(cè)與序列分析32
• 1.2.6 EMSA實(shí)驗(yàn)32-38
• 1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理38
• 2 結(jié)果與分析38-44
• 2.1 鴨FTH1基因啟動(dòng)子區(qū)系列缺失表達(dá)載體的酶切鑒定38-39
• 2.2 鴨FTH1基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的檢測(cè)39-40
• 2.3 鴨FTH1基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性區(qū)SNP檢測(cè)40
• 2.4 -54C>T轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析40-41
• 2.5 定點(diǎn)突變表達(dá)載體的構(gòu)建與活性檢測(cè)41-42
• 2.6 EMSA結(jié)果42-44
• 2.6.1 提取DF1細(xì)胞的核蛋白濃度42-43
• 2.6.2 EMSA凝膠遷移結(jié)果43-44
• 3 討論44-46
• 全文結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-55
• 附錄55-56
• 致謝56-57
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄57-58

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