本文關(guān)鍵詞：禽致病性大腸桿菌lsr操縱子調(diào)控作用研究

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【摘要】：禽致病性大腸桿菌(Avain Pathogenic Escherichia coli,APEC)能引起禽類嚴(yán)重的呼吸道和全身性感染,由于其廣泛的耐藥性、復(fù)雜的血清型和致病機(jī)制,一直制約對(duì)該菌的有效防控。密度感應(yīng)(Qurom Sensing,QS)是細(xì)菌通過分泌自誘導(dǎo)物(Autoinducer,AI),并以此進(jìn)行“交流”,監(jiān)控群體密度,進(jìn)而協(xié)調(diào)基因表達(dá),調(diào)控多種生物功能的過程。Lux S/AI-2型密度感應(yīng)系統(tǒng)廣泛存在于革蘭氏陰性和陽性菌中,通過產(chǎn)生AI-2信號(hào)分子實(shí)現(xiàn)對(duì)不同種屬細(xì)菌的生理功能調(diào)控。在鼠傷寒沙門氏菌中,AI-2對(duì)細(xì)菌生理功能的調(diào)控是通過lsr操縱子(包含8個(gè)基因,分別是lsr K、lsr R、lsr A、lsr C、lsr D、lsr B、lsr F、lsr G)對(duì)AI-2的轉(zhuǎn)運(yùn)、內(nèi)化實(shí)現(xiàn)的,而在APEC中尚未見相關(guān)研究,因此,研究lsr操縱子對(duì)AI-2的轉(zhuǎn)運(yùn)、內(nèi)化的機(jī)制,為從QS層面開展對(duì)APEC的防控提供新思路。本研究開展了如下研究:1.大腸桿菌MG6155Δlsr B的構(gòu)建及AI-2內(nèi)化檢測(cè)MG1655Δlsr B利用Red同源重組法,構(gòu)建大腸桿菌MG1655的lsr B缺失株MG1655Δlsr B。運(yùn)用哈維弧菌BB170菌株對(duì)野生株MG1655與缺失株MG1655Δlsr B的AI-2內(nèi)化動(dòng)力學(xué)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果lsr B缺失后,MG1655不能完全內(nèi)化AI-2,表明在MG1655中,lsr操縱子在AI-2內(nèi)化、轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮重要作用,也為研究APEC中l(wèi)sr操縱子是否具有類似功能提供重要依據(jù)。2.APEC中l(wèi)sr操縱子同源序列檢測(cè)為探討APEC中是否存在lsr操縱子,依據(jù)大腸桿菌MG1655的lsr操縱子序列,設(shè)計(jì)8對(duì)引物對(duì)APEC O_1、O_2、O_(78)三個(gè)血清型共60株分離株進(jìn)行PCR檢測(cè)。其中,在22株APEC O_(78)血清型中,lsr操縱子檢出率為95.5%;在16株APEC O_1血清型分離株中,lsr操縱子檢出率為68.8%;在22株APEC O_2血清型分離株中,lsr操縱子檢出率為40.9%。對(duì)APEC O_1、O_2、O_(78)三個(gè)血清型lsr操縱子的檢測(cè)結(jié)果表明,參與AI-2內(nèi)化的lsr操縱子在APEC菌株中的分布具有血清型相關(guān)型,在APEC O_(78)血清型中檢出率最高,而O_2血清型最低。3.APEC的LsrB與AI-2結(jié)合驗(yàn)證以APEC菌株APEC94(血清型為O_(78))研究對(duì)象,對(duì)包含8個(gè)基因的lsr操縱子進(jìn)行測(cè)序。將APEC94的lsr操縱子序列與MG1655中l(wèi)sr操縱子序列進(jìn)行分析。結(jié)果表明,其核苷酸同源性為99%。大腸桿菌MG1655的lsr B基因能編碼AI-2受體蛋白,為了研究是否APEC中的lsr B基因具有類似功能,本研究構(gòu)建了p Cold TF-LsrB表達(dá)載體,分別以BL21(DE3)和BL21?lux S(DE3)為宿主菌對(duì)APEC的LsrB重組蛋白進(jìn)行表達(dá)、純化。AI-2結(jié)合試驗(yàn)表明,BL21?lux S(DE3)表達(dá)的LsrB重組蛋白具有結(jié)合AI-2的活性,結(jié)合的AI-2分子可通過對(duì)蛋白的熱變性進(jìn)行釋放。AI-2釋放試驗(yàn)表明,BL21(DE3)表達(dá)的LsrB重組蛋白能結(jié)合內(nèi)源性(自身產(chǎn)生)的AI-2,能夠通過對(duì)蛋白熱變性釋放結(jié)合的AI-2。本研究結(jié)果表明APEC94的LsrB蛋白具有AI-2結(jié)合活性,因此推測(cè)在APEC中,具有LsrB樣AI-2結(jié)合受體。4.APEC的lsr操縱子缺失株構(gòu)建及生物學(xué)特性分析利用同源重組法構(gòu)建了APEC94的lsr操縱子缺失株APEC94Δlsr(Cm),并對(duì)野生株和缺失株的生物學(xué)特性進(jìn)行研究。結(jié)果表明,缺失株與野生株相比,其生長(zhǎng)曲線及生物被膜形成能力無明顯差異(P㧐0.05)。對(duì)9日齡櫻桃谷鴨的半數(shù)致死量測(cè)定結(jié)果表明,野生株與缺失株的LD50分別為8.66×105和2.55×108 CFU,缺失株毒力下降了約294倍。對(duì)9日齡櫻桃谷鴨以1.0×109 CFU劑量分別用野生和缺失株進(jìn)行攻毒,24 h后缺失株和野生株在雛鴨血液中載菌量分別為2.5×104和6.5×102CFU/m L(P㩳0.0001);肝臟內(nèi)載菌量分別為5.9×108和3.6×105 CFU/m L(P㩳0.0001);脾臟內(nèi)的載菌量分別為1.9×1010和6.0×105 CFU/m L(P㩳0.0001);腎臟內(nèi)的載菌量6.1×108、8.1×105 CFU/m L(P㩳0.0001)。表明缺失lsr操縱子后,APEC對(duì)宿主的致病性顯著降低,推測(cè)lsr操縱子對(duì)APEC的致病性具有重要的調(diào)控作用,具體調(diào)節(jié)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果表明,APEC存在Lsr樣AI-2內(nèi)化操縱子,且該操縱子分布與血清型相關(guān);APEC的LsrB具有AI-2結(jié)合活性;lsr操縱子對(duì)APEC毒力具有重要的調(diào)控作用。本研究將為進(jìn)一步研究AI-2對(duì)APEC的調(diào)控作用以及基于群體感應(yīng)角度開展對(duì)APEC的防控提供新思路。
【關(guān)鍵詞】：禽致病性大腸桿菌 密度感應(yīng) AI-2 AI-2受體 lsr操縱子
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 英文縮略表13-14
• 第一章 引言14-24
• 1.1 禽致病性大腸桿菌研究進(jìn)展14-17
• 1.1.1 禽大腸桿菌病14
• 1.1.2 禽致病性大腸桿菌的多樣性14
• 1.1.3 禽致病性大腸桿菌的致病機(jī)制14-15
• 1.1.4 禽致病性大腸桿菌毒力因子研究進(jìn)展15-16
• 1.1.5 禽致病性大腸桿菌的防治措施16-17
• 1.2 密度感應(yīng)系統(tǒng)研究進(jìn)展17-19
• 1.2.1 密度感應(yīng)概述17-18
• 1.2.2 密度感應(yīng)系統(tǒng)分類18-19
• 1.3 LUXS/AI-2 型密度感應(yīng)系統(tǒng)19-24
• 1.3.1 AI-2 的合成19-20
• 1.3.2 AI-2 內(nèi)化通路的研究進(jìn)展20-23
• 1.3.3 AI-2 信號(hào)分子的應(yīng)用23-24
• 第二章 大腸桿菌MG1655Δ lsrB缺失株構(gòu)建及AI-2 內(nèi)化特性的檢測(cè)24-31
• 2.1 材料24-25
• 2.1.1 菌株及質(zhì)粒24
• 2.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基24-25
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備25
• 2.2 方法25-27
• 2.2.1 PCR引物設(shè)計(jì)25-26
• 2.2.2 MG1655Δlsr缺失株的構(gòu)建26-27
• 2.2.3 缺失株內(nèi)化外源AI-2 能力檢測(cè)試驗(yàn)27
• 2.3 結(jié)果27-29
• 2.3.1.MG1655ΔlsrB突變株的鑒定27-28
• 2.3.2 MG1655與MG1655ΔlsrB內(nèi)化外源性AI-2 的檢測(cè)28-29
• 2.4 討論29-31
• 第三章 禽致病性大腸桿菌lsr操縱子的檢測(cè)31-39
• 3.1 材料與方法31-32
• 3.1.1 菌株31
• 3.1.2 主要試劑31-32
• 3.1.3 主要儀器設(shè)備32
• 3.2 方法32-34
• 3.2.1 PCR引物設(shè)計(jì)32-33
• 3.2.2 菌株培養(yǎng)33
• 3.2.3 PCR擴(kuò)增禽致病性大腸桿菌不同血清型中的lsr操縱子基因33-34
• 3.3 結(jié)果34-37
• 3.3.1 PCR檢測(cè)APEC的lsr操縱子34
• 3.3.2 lsr操縱子基因在59株禽致病性大腸桿菌中分布統(tǒng)計(jì)34-37
• 3.4 討論37-39
• 第四章 禽致病性大腸桿菌LsrB蛋白與AI-2 的結(jié)合活性驗(yàn)證39-48
• 4.1 材料39-40
• 4.1.1 菌株39
• 4.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基39
• 4.1.3 主要儀器設(shè)備39-40
• 4.2 方法40-43
• 4.2.1 LsrB蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建40-41
• 4.2.2 LsrB蛋白表達(dá)41-42
• 4.2.3 LsrB蛋白大量表達(dá)，純化42
• 4.2.4 LsrB重組蛋白與AI-2 結(jié)合活性驗(yàn)證42-43
• 4.3 結(jié)果43-46
• 4.3.1 pCold-lsrB載體鑒定43-44
• 4.3.2 LsrB重組蛋白的表達(dá)、可溶性分析及純化44-45
• 4.3.3 LsrB重組蛋白與AI-2 結(jié)合的活性驗(yàn)證45-46
• 4.4 討論46-48
• 第五章 lsr操縱子缺失及生物學(xué)特性分析48-55
• 5.1 材料48-49
• 5.1.1 菌株及質(zhì)粒48
• 5.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基48
• 5.1.3 主要儀器設(shè)備48-49
• 5.2 方法49-50
• 5.2.1 PCR引物設(shè)計(jì)49
• 5.2.2 APEC94 lsr操縱子缺失株的構(gòu)建49-50
• 5.2.3 APEC94及APEC94Δlsr（Cm）生長(zhǎng)曲線測(cè)定50
• 5.2.4 生物被膜形成能力檢測(cè)50
• 5.2.5 APEC94野生株、APEC94Δlsr（Cm）缺失株半數(shù)致死量LD50的檢測(cè)50
• 5.2.6 體內(nèi)分布50
• 5.3 結(jié)果50-53
• 5.3.1 APEC94Δlsr突變株的鑒定50-51
• 5.3.2 生長(zhǎng)曲線測(cè)定51-52
• 5.3.3 生物被膜形成能力檢測(cè)52
• 5.3.4 APEC94野生株、APEC94Δlsr（Cm）缺失株LD50的測(cè)定52-53
• 5.3.5 體內(nèi)分布53
• 5.4 討論53-55
• 第六章 全文結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-63
• 致謝63-64
• 作者簡(jiǎn)歷64

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