本文關(guān)鍵詞：牛分枝桿菌肝素結(jié)合血凝素（HBHA）的黏附功能鑒定

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【摘要】：牛結(jié)核病(Bovine tuberculosis)是由牛分枝桿菌(M.bovis)引起的一種慢性、消耗性人獸共患病,給畜牧業(yè)發(fā)展和公共衛(wèi)生帶來了嚴(yán)重的危害。HBHA蛋白是牛分枝桿菌hbha基因編碼的一種表面蛋白,是毒力因子之一,M.bovis對(duì)細(xì)胞的黏附能力是其毒力的重要指標(biāo)之一,是建立感染的先決條件。因此本試驗(yàn)對(duì)HBHA的黏附功能進(jìn)行研究:1.HBHA的原核表達(dá)、多抗制備及黏附性試驗(yàn)。以M.bovis valleeⅢ基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增hbha基因,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a(+)-hbha,轉(zhuǎn)化至Ecoli BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE分析表明,重組蛋白分子量約為28 ku,主要以可溶形式表達(dá)。用鎳柱純化HBHA蛋白至電泳出現(xiàn)單一條帶,濃度為3.6μg/μL。加弗氏佐劑乳化,免疫新西蘭大白兔制備多抗,經(jīng)過Western-blot分析,可以與M.bovis全菌蛋白反應(yīng),表明其具有抗原性。將HBHA和A549細(xì)胞共孵育,熒光顯微鏡觀察,HBHA蛋白能夠黏附于A549細(xì)胞表面。2.重組恥垢分枝桿菌HBHA-mc2155的構(gòu)建及黏附功能鑒定。構(gòu)建重組質(zhì)粒pMV361-hbha,電轉(zhuǎn)化至恥垢分枝桿菌mc2155,并用Western-blot驗(yàn)證表達(dá),結(jié)果顯示在分子量約為28 ku處可見單一條帶,表明HBHA在mc2155中成功表達(dá)。以His mAb為一抗,羊抗兔IgG-FITC為二抗,熒光顯微鏡觀察,該蛋白表達(dá)在HBHA-mc2155膜表面。將HBHA-mc2155與A549細(xì)胞共孵育,以His mAb為一抗,以羊抗鼠IgG-FITC為二抗,HBHA多抗為阻斷劑,進(jìn)行黏附及黏附抑制試驗(yàn),熒光顯微鏡觀察,HBHA-mc2155可黏附于A549細(xì)胞表面,HBHA多抗可阻斷其黏附。以A549為試驗(yàn)細(xì)胞,HBHA-mc2155和mc2155平行進(jìn)行黏附試驗(yàn),以兔抗mc2155全菌多抗為一抗,羊抗兔IgG-FITC為二抗,流式細(xì)胞術(shù)檢測A549細(xì)胞,計(jì)算可知黏附率達(dá)到49%。黏附和黏附抑制試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與mc2155相比,HBHA-mc2155黏附A549細(xì)胞的能力明顯提高,而這種黏附能力的升高可被HBHA所抑制。3.HBHA-mc2155的動(dòng)物致病性試驗(yàn)。以BALB/c小鼠為動(dòng)物模型,將HBHA-mc2155和mc2155經(jīng)腹腔免疫小鼠,30 d后取小鼠肺臟做石蠟切片,HE染色鏡檢,結(jié)果表明,與mc2155相比,HBHA-mc2155能造成小鼠肺泡隔明顯增寬,肺泡內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤等變化。
【關(guān)鍵詞】：牛分枝桿菌 恥垢分枝桿菌 黏附素 HBHA蛋白
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 摘要3-5
• Summary5-7
• 縮略語表7-11
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述11-18
• 1 牛結(jié)核病的病原學(xué)11-12
• 2 國內(nèi)外牛結(jié)核病的地域分布以及流行情況12-14
• 2.1 發(fā)達(dá)國家牛結(jié)核病的分布及流行情況12-13
• 2.2 發(fā)展中國家牛結(jié)核病的流行情況13
• 2.3 我國的牛結(jié)核病流行情況13-14
• 3 牛結(jié)核病的危害14-15
• 4 牛分枝桿菌致病機(jī)理及致病性15
• 5 牛分枝桿菌免疫機(jī)理15-16
• 6 牛結(jié)核病的防制16
• 7 hbha基因研究進(jìn)展16-17
• 8 本課題研究及意義17-18
• 第二篇 試驗(yàn)部分18-46
• 第一章 牛分枝桿菌hbha基因的克隆表達(dá)及黏附性試驗(yàn)18-34
• 1 材料與方法18-29
• 1.1 材料18-21
• 1.2 M.bovis基因組的提取21
• 1.3 M.bovis hbha基因引物設(shè)計(jì)21
• 1.4 M.bovis hbha基因的擴(kuò)增21
• 1.5 hbha基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化21-22
• 1.6 pET28a(+)載體質(zhì)粒的提取22-23
• 1.7 hbha基因回收產(chǎn)物與pET28a(+)表達(dá)載體雙酶切23
• 1.8 大腸桿菌DH5α 感受態(tài)的制備23
• 1.9 hbha基因回收產(chǎn)物與pET28a(+)表達(dá)載體的連接轉(zhuǎn)化23-24
• 1.10 HBHA蛋白原核表達(dá)及純化24-26
• 1.11 HBHA多克隆抗體的制備26-27
• 1.12 HBHA多克隆抗體效價(jià)的檢測27
• 1.13 HBHA的Western blot驗(yàn)證27-28
• 1.14 A549細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代28
• 1.15 HBHA蛋白的黏附性檢測28-29
• 2 結(jié)果29-33
• 2.1 hbha基因PCR擴(kuò)增結(jié)果29
• 2.2 pET-hbha重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定29-30
• 2.3 rMbHBHA的SDS-PAGE電泳分析30-31
• 2.4 HBHA多克隆抗體效價(jià)檢測31
• 2.5 HBHA的western-blot驗(yàn)證31-32
• 2.6 HBHA蛋白的黏附性檢測32-33
• 3 討論33-34
• 第二章 肝素結(jié)合血凝素的黏附功能鑒定34-46
• 1 材料與方法34-40
• 1.1 材料34-35
• 1.2 hbha基因片段與pMV361載體的連接轉(zhuǎn)化35
• 1.3 重組恥垢分枝桿菌HBHA-mc~2155的構(gòu)建與鑒定35-37
• 1.4 重組蛋白表達(dá)的檢測37
• 1.5 HBHA蛋白在HBHA-mc~2155中的分布37
• 1.6 HBHA- mc~2155的黏附和黏附阻斷試驗(yàn)37-39
• 1.7 HBHA- mc~2155動(dòng)物致病性試驗(yàn)39-40
• 2 結(jié)果40-44
• 2.1 HBHA-mc~2155的鑒定40-41
• 2.2 HBHA蛋白在HBHA-mc~2155中的分布41-42
• 2.3 HBHA-mc~2155對(duì)A549細(xì)胞的黏附及黏附阻斷試驗(yàn)42-43
• 2.4 HBHA-mc~2155對(duì)小鼠致病性試驗(yàn)43-44
• 3 討論44-46
• 全文總結(jié)46-47
• 參考文獻(xiàn)47-54
• 致謝54-55
• 作者簡介55-56
• 導(dǎo)師簡介56-57

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：746110