本文關(guān)鍵詞：牛支原體TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的研究

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【摘要】：牛支原體病是由牛支原體引起的一種可導(dǎo)致多種病癥的傳染病。為了快速準(zhǔn)確的診斷該病,本研究在參考國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上,選取OPPD /F作為特異性基因,設(shè)計(jì)合成引物和探針,建立了牛支原體1aqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。目的：本研究旨在建立一種快速檢測(cè)牛支原體的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。方法：根據(jù)GenBan k中收錄的牛支原體OPPD/F基因序列(登錄號(hào)：AF130119),利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物與TaqMan探針,以重組質(zhì)粒作為絕對(duì)定量的模板,構(gòu)建檢測(cè)牛支原體的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。結(jié)果：所構(gòu)建的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法線性關(guān)系良好,標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2=0.994,擴(kuò)增效率E=1.28。熒光定量PCR法檢測(cè)的敏感性是常規(guī)PCR的10倍；特異性良好,檢測(cè)9種相關(guān)細(xì)菌和病毒均為陰性；重復(fù)性好,組內(nèi)及組間樣本檢測(cè)Ct值均小于2%。結(jié)論：牛支原體TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法較之于常規(guī)PCR方法有快速、特異性強(qiáng)、敏感性高、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：牛支原體 OPPD/F基因 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.62
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 1 引言10-21
• 1.1 牛支原體病簡(jiǎn)介10-11
• 1.2 牛支原體的病原學(xué)特性11-12
• 1.2.1 牛支原體的形態(tài)特征11
• 1.2.2 牛支原體的基因組學(xué)11
• 1.2.3 牛支原體的生長(zhǎng)及繁殖特性11-12
• 1.2.4 牛支原體的理化特性12
• 1.3 牛支原體病的流行病學(xué)12-13
• 1.4 牛支原體病的臨床癥狀13-14
• 1.4.1 最急性13-14
• 1.4.2 急性14
• 1.4.3 慢性14
• 1.5 牛支原體病的病理變化14
• 1.6 牛支原體病的致病機(jī)理14-15
• 1.7 牛支原體病的免疫機(jī)理15
• 1.8 牛支原體病的診斷15-17
• 1.8.1 病原的分離培養(yǎng)15-16
• 1.8.2 血清學(xué)診斷16
• 1.8.3 分子生物學(xué)診斷方法16-17
• 1.9 牛支原體病的治療17
• 1.10 牛支原體病的防控措施17-18
• 1.10.1 加強(qiáng)飼養(yǎng)管理17-18
• 1.10.2 加強(qiáng)消毒工作18
• 1.10.3 加強(qiáng)檢疫監(jiān)管18
• 1.11 牛支原體病疫苗研究進(jìn)展18-19
• 1.12 實(shí)時(shí)熒光定量PCR19-20
• 1.12.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR簡(jiǎn)介19
• 1.12.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的類別19-20
• 1.13 本研究的目的及意義20-21
• 2 材料與方法21-27
• 2.1 材料21
• 2.1.1 菌株、病毒株及病原核酸21
• 2.1.2 牛支原體病病牛鼻拭子臨床樣本21
• 2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器21
• 2.1.4 主要實(shí)驗(yàn)試劑21
• 2.1.5 引物和探針21
• 2.2 方法21-27
• 2.2.1 牛支原體基因組DNA的提取22
• 2.2.2 牛支原體種屬特異性片段(OPPD/F)的擴(kuò)增22
• 2.2.3 目的片段的回收22-23
• 2.2.4 目的片段與克隆載體的連接及轉(zhuǎn)化感受態(tài)trans5α23
• 2.2.5 重組質(zhì)粒提取及鑒定23-24
• 2.2.6 重組陽(yáng)性質(zhì)粒拷貝數(shù)測(cè)定24
• 2.2.7 熒光定量PCR反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化24-25
• 2.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立25
• 2.2.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的敏感性試驗(yàn)25
• 2.2.10 熒光定量PCR的特異性試驗(yàn)25-26
• 2.2.11 熒光定量PCR的重復(fù)性試驗(yàn)26
• 2.2.12 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法臨床樣品檢測(cè)26-27
• 3 結(jié)果27-33
• 3.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備及鑒定結(jié)果27-28
• 3.1.1 常規(guī)PCR的擴(kuò)增結(jié)果27
• 3.1.2 重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果27-28
• 3.1.3 目的片段測(cè)序鑒定結(jié)果28
• 3.1.4 質(zhì)�？截悢�(shù)計(jì)算結(jié)果28
• 3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系的建立結(jié)果28-33
• 3.2.1 TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化結(jié)果28-29
• 3.2.2 TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果29
• 3.2.3 TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果29-30
• 3.2.4 TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果30
• 3.2.5 TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果30-32
• 3.2.6 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果32-33
• 4 討論33-35
• 5 結(jié)論35-36
• 致謝36-37
• 參考文獻(xiàn)37-42
• 作者簡(jiǎn)介42

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