本文關(guān)鍵詞：一步反轉(zhuǎn)錄FRET-qPCR檢測(cè)甲型流感病毒方法的建立及應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： 一步反轉(zhuǎn)錄FRET-qPCR 甲型流感病毒 活禽市場(chǎng) 家禽拭子樣品

【摘要】：流感病毒基于其核蛋白抗原的多樣性,分為甲(A)型、乙(B)型、丙(C)型,其中甲型流感病毒(Influenza A virus, IAV)具有廣泛的宿主譜；抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換導(dǎo)致新IAV血清亞型和變異株不斷出現(xiàn),甚至產(chǎn)生高致病性強(qiáng)毒株,并且可能跨越物種障礙進(jìn)而感染人類,造成局部地區(qū)乃至世界范圍流感疫情的暴發(fā)。因此,IAV不同血清亞型和變異株的快速檢測(cè)對(duì)甲型流感的防控具有重要意義。目前IAV檢測(cè)方法主要有病原學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)診斷技術(shù)。其中病原學(xué)方法耗時(shí)費(fèi)力；血清學(xué)方法特異性較低,容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)；分子生物學(xué)診斷技術(shù)敏感性和特異性較強(qiáng),但多為兩步法,且不能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)IAV血清亞型。因此,本研究主要是建立一種快速靈敏,可檢測(cè)所有常見(jiàn)IAV血清亞型的方法,并且成功地應(yīng)用于我國(guó)活禽市場(chǎng)家禽的IAV檢測(cè)。一步反轉(zhuǎn)錄FRET-qPCR檢測(cè)甲型流感病毒方法的建立本研究主要是基于68個(gè)IAV血清亞型的基質(zhì)蛋白(M)基因,設(shè)計(jì)特異性引物和探針,建立一種一步反轉(zhuǎn)錄FRET-qPCR檢測(cè)IAV的方法(PCR產(chǎn)物169 bp)。將特異性引物和探針進(jìn)行BLAST檢索,證實(shí)與IAV血清亞型高度匹配的有122個(gè),包含28,206個(gè)IAV序列。應(yīng)用該方法對(duì)H1N1血清亞型病毒株制備的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè),表明其靈敏度達(dá)到10拷貝／反應(yīng);對(duì)9株IAV血清亞型病毒株(H1N1、H3N3、H4N6、H5N1、H6N1、H7N9、 H9N2、H10N8、H11N2)的敏感性檢測(cè),表明該方法優(yōu)于傳統(tǒng)的雞胚半數(shù)感染量(EID50)測(cè)定方法。此外,本試驗(yàn)采集SPF雞的咽喉和泄殖腔拭子,加入不同稀釋度的H9N2,分別用于一步反轉(zhuǎn)錄FRET-qPCR方法和EID50試驗(yàn)；并建立基于IAV聚合酶蛋白(PA)基因的反轉(zhuǎn)錄PCR方法(575 bp),對(duì)一步反轉(zhuǎn)錄FRET-qPCR檢測(cè)的陽(yáng)性樣品進(jìn)行驗(yàn)證。本研究建立的方法快速靈敏,可同時(shí)檢測(cè)出所有常見(jiàn)IAV血清亞型,為甲型流感疫情的監(jiān)測(cè)和防控提供重要技術(shù)支撐。一步反轉(zhuǎn)錄FRET-qPCR檢測(cè)甲型流感病毒方法的應(yīng)用從我國(guó)24省的活禽市場(chǎng)采集1,839只家禽(雞1,521只、鴨127只、鵝100只、鴿子91只)的咽喉和泄殖腔拭子樣品,應(yīng)用本研究建立的一步反轉(zhuǎn)錄FRET-qPCR方法進(jìn)行IAV檢測(cè)。結(jié)果表明,家禽IAV的陽(yáng)性率為9.2%(169/1,839),其中雞的IAV陽(yáng)性率最高(10.4%;158/1,521),其次是鴨(5.5%；7/127),鴿子(4.4%;4/91),鵝(0%；0/100)；咽喉拭子的IAV陽(yáng)性率(7.5%；138/1,839)顯著高于泄殖腔拭子的IAV陽(yáng)性率(5.2%；95/1,839;P104),同時(shí)咽喉拭子含有的IAV拷貝數(shù)也明顯高于泄殖腔拭子(106.07vs.105.54；P10-4);咽喉和泄殖腔拭子均為陽(yáng)性的家禽占總陽(yáng)性家禽的27.8%(47/169),僅咽喉拭子為陽(yáng)性的家禽占47.9%(81/169),僅泄殖腔拭子為陽(yáng)性的家禽占24.3%(41/169)。應(yīng)用基于PA、血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)基因的PCR方法,進(jìn)一步對(duì)反轉(zhuǎn)錄FRET-qPC R檢測(cè)的陽(yáng)性樣品進(jìn)行IAV血清亞型判定。結(jié)果表明,在IAV陽(yáng)性家禽樣品中,H9N2血清亞型占56.8%(96/169),H7N9血清亞型占41.4%(70/169), H5N1血清亞型占1.8%(3/169)。H9N2血清亞型的家禽包括雞(95.8%；92/96)和鴨(4.2%；4/96),在96個(gè)H9N2血清亞型的家禽中,咽喉和泄殖腔拭子均為H9N2血清亞型的家禽占9.3%(9/96),僅咽喉拭子為H9N2血清亞型的家禽占71.9%(69/96),僅泄殖腔拭子為H9N2血清亞型的家禽占18.8%(18/96)；H7N9血清亞型的家禽包括雞(94.3%；66/70)和鴿子(5.7%;4/70),在70個(gè)H7N9血清亞型的家禽中,咽喉和泄殖腔拭子均為H7N9血清亞型的家禽占51.4%(36/70),僅咽喉拭子為H7N9血清亞型的家禽占15.7%(11/70),僅泄殖腔拭子為H7N9血清亞型的家禽占32.9%(23/70)；H5N1血清亞型僅在鴨中檢出(n=3),其中2只的咽喉和泄殖腔拭子均為H5N1血清亞型,1只僅咽喉拭子為H5N1血清亞型。綜上所述,本研究建立了基于M基因檢測(cè)IAV血清亞型的一步反轉(zhuǎn)錄FRET-qPCR方法,并通過(guò)基于PA、HA和NA基因的反轉(zhuǎn)錄PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)用該方法對(duì)我國(guó)24省的活禽市場(chǎng)中家禽咽喉和泄殖腔拭子進(jìn)行檢測(cè)分型的結(jié)果表明,家禽IAV的陽(yáng)性率為9.2%(169/1,839),其中雞的IAV陽(yáng)性率最高(10.4%；158/1,521)；咽喉拭子的IAV陽(yáng)性率(7.5%;138/1,839)顯著高于泄殖腔拭子的IAV陽(yáng)性率(5.2%；95/1,839;P10-4),同時(shí)咽喉拭子含有的IAV拷貝數(shù)也明顯高于泄殖腔拭子(106.07 vs.105.54；P10.4)；在IAV陽(yáng)性家禽樣品中,H9N2和H7N9血清亞型分別占56.8%(96/169)和41.4%(70/169)。本研究建立的一步反轉(zhuǎn)錄FRET-qPCR方法靈敏度高,能快速方便地檢測(cè)出所有常見(jiàn)IAV血清亞型,為甲型流感的監(jiān)測(cè)和防控提供重要參考和技術(shù)支撐。
【關(guān)鍵詞】：一步反轉(zhuǎn)錄FRET-qPCR 甲型流感病毒 活禽市場(chǎng) 家禽拭子樣品
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-9
• 符號(hào)說(shuō)明9-10
• 第一章 文獻(xiàn)綜述10-26
• 1 甲型流感病毒的研究進(jìn)展10-14
• 1.1 概述10-12
• 1.2 甲型流感病毒的結(jié)構(gòu)12-13
• 1.3 甲型流感病毒的抗原變異13-14
• 2 甲型流感病毒的診斷技術(shù)14-18
• 2.1 病原學(xué)診斷技術(shù)14-15
• 2.2 血清學(xué)診斷技術(shù)15-16
• 2.3 分子生物學(xué)診斷技術(shù)16-18
• 3 活禽市場(chǎng)的甲型流感病毒現(xiàn)狀18-19
• 4 參考文獻(xiàn)19-26
• 第二章 一步反轉(zhuǎn)錄FRET-qPCR檢測(cè)甲型流感病毒方法的建立26-50
• 前言27-28
• 1 材料28-29
• 1.1 病毒株、雞胚和拭子樣品28
• 1.2 主要試劑28
• 1.3 主要儀器28-29
• 2 方法29-38
• 2.1 全核酸的提取29-30
• 2.2 基于基質(zhì)蛋白基因一步反轉(zhuǎn)錄FRET-qPCR方法的建立30-33
• 2.3 FRET-qPCR方法靈敏度測(cè)定33-35
• 2.4 FRET-qPCR方法與EID_(50)試驗(yàn)敏感性比較35-36
• 2.5 FRET-qPCR方法特異性驗(yàn)證36
• 2.6 FRET-qPCR方法的可行性探究36-37
• 2.7 基于聚合酶蛋白基因反轉(zhuǎn)錄PCR方法的建立37-38
• 3 結(jié)果38-45
• 3.1 檢測(cè)甲型流感病毒一步反轉(zhuǎn)錄FRET-qPCR方法38-41
• 3.2 FRET-qPCR方法敏感性測(cè)定41-44
• 3.3 FRET-qPCR方法特異性驗(yàn)證44
• 3.4 FRET-qPCR方法的可行性探究44-45
• 3.5 反轉(zhuǎn)錄PCR方法進(jìn)一步驗(yàn)證45
• 4 討論45-47
• 5 參考文獻(xiàn)47-50
• 第三章 一步反轉(zhuǎn)錄FRET-qPCR檢測(cè)甲型流感病毒方法的應(yīng)用50-61
• 前言51-52
• 1 材料52-53
• 1.1 咽喉和泄殖腔拭子樣品52
• 1.2 主要試劑52
• 1.3 主要儀器52-53
• 2 方法53-54
• 2.1 全核酸的提取53
• 2.2 FRET-qPCR方法的應(yīng)用53
• 2.3 甲型流感H9N2、H7N9和H5N1血清亞型的驗(yàn)證53
• 2.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及測(cè)序分析53
• 2.5 統(tǒng)計(jì)分析53-54
• 3 結(jié)果54-56
• 3.1 活禽市場(chǎng)中家禽的IAV流行率54
• 3.2 活禽市場(chǎng)中家禽的3種IAV血清亞型分布54-56
• 3.3 家禽咽喉及泄殖腔拭子中3種IAV血清亞型分布56
• 4 討論56-57
• 5 參考文獻(xiàn)57-61
• 全文總結(jié)61-62
• 致謝62-63
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄63-64

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：723660