本文關鍵詞：A型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗的臨床應用和保護效果評價

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【摘要】：產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens),又稱魏氏梭菌,存在于很多健康動物的腸道中,當飼養(yǎng)和環(huán)境條件改變時,可引起畜禽的的產氣莢膜梭菌病,一旦發(fā)病,會導致畜禽迅速死亡,病程極短,往往在未得到有效治療前便死亡。近年來產氣莢膜梭菌病已經致使養(yǎng)殖業(yè)遭受巨大經濟損失。其中A型產氣莢膜梭菌是引起家兔腹瀉性腸炎的主要致病菌,該菌在腸道內繁殖產生α毒素導致家兔發(fā)病。此類病的發(fā)病急、死亡率高、發(fā)病后用藥治療效果不明顯,因此為了有效預防和控制產氣莢膜梭菌病的發(fā)生,研制高效、安全的類毒素疫苗和評價其效力刻不容緩。ELISA方法,具有特異、敏感、迅速、可以大批量檢測抗體的優(yōu)勢,可用于檢測和診斷產氣莢膜梭菌病,也可應用于疫苗保護效果的評價及流行病學調查。本研究對A型產氣莢膜梭菌標準菌種(NCTC528)進行復蘇、增菌、產毒,得到以α毒素為主的外毒素溶液。將制備的外毒素通過甲醛滅活,與白油佐劑混合乳化后,成功制備了A型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗;另一方面;將外毒素經過過濾除菌,飽和硫酸銨沉淀等方法對外毒素蛋白進行提取。以毒素蛋白作為間接ELISA的包被抗原,摸索優(yōu)化反應條件,最終建立了產氣莢膜梭菌毒素抗體檢測的間接ELISA方法。運用該方法對免疫過疫苗的家兔進行抗體水平的連續(xù)監(jiān)測,以此來確定疫苗的最小免疫劑量和合理的免疫程序。疫苗臨床保護效果的評價試驗:將疫苗分為4個不同的劑量,分別對28日齡和45日齡的家兔各400只首免,28日齡家兔長至45日齡時對家兔進行二免;通過攻毒保護實驗和對血清抗體效價的連續(xù)監(jiān)測,結果顯示,當家兔血清抗體效價達到6.83×100log2左右時,疫苗對家兔保護效果較好;最終確定了疫苗最小免疫劑量為0.5ml,二免后保護效果更佳。
【關鍵詞】：A型產氣莢膜梭菌 類毒素疫苗 間接ELISA 血清抗體
【學位授予單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4
【目錄】：

• 符號說明4-8
• 中文摘要8-9
• 英文摘要9-11
• 1 前言11-18
• 1.1 產氣莢膜梭菌概述11-13
• 1.2 產氣莢膜梭菌病在國內外的流行情況及其影響13-15
• 1.3 α毒素的生物學研究15-16
• 1.4 產氣莢膜梭菌疾病致病機理及防控措施16-17
• 1.5 研究的進展和意義17-18
• 2 材料和方法18-25
• 2.1 菌種與培養(yǎng)基18
• 2.1.1 A型產氣莢膜梭菌種18
• 2.1.2 5%綿羊血瓊脂基礎平板18
• 2.1.3 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基FTG增菌液18
• 2.1.4 Gordon湯產毒培養(yǎng)基18
• 2.1.5 PBS的配制18
• 2.2 實驗動物18-19
• 2.3 主要儀器及試劑19
• 2.4 主要試劑配制19-20
• 2.5 試驗方法20-24
• 2.5.1 菌種復蘇20
• 2.5.2 增菌20
• 2.5.3 毒素的制備20-21
• 2.5.4 A型產氣莢膜梭菌外毒素的提取21
• 2.5.4.1 外毒素的粗提21
• 2.5.4.2 應用SephadexG-25方法對毒素透析除鹽21
• 2.5.5 聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE)法檢測外毒素中的α毒素21-22
• 2.5.6 外毒素毒力的測定22
• 2.5.7 外毒素對家兔最小致死量的測定22
• 2.5.8 A型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備22
• 2.5.9 類毒素疫苗的檢測22-23
• 2.5.9.1 穩(wěn)定性檢測22
• 2.5.9.2 甲醛及硫柳汞的檢驗22-23
• 2.5.9.3 安全性檢驗23
• 2.5.10間接ELISA檢測方法的建立23-24
• 2.5.10.1 包被抗原最佳稀釋度確定23
• 2.5.10.2 最佳封閉條件的選擇23
• 2.5.10.3 樣品最佳反應時間的確定23
• 2.5.10.4 酶標二抗孵育時間的確定23
• 2.5.10.5 顯色底物作用時間的選擇23
• 2.5.10.6 間接ELISA方法的基本操作程序23-24
• 2.5.11 間接ELISA方法的性能評價24
• 2.5.11.1 特異性實驗24
• 2.5.11.2 敏感性實驗24
• 2.5.11.3 重復性實驗24
• 2.6 間接ELISA方法對疫苗免疫效果的評價24-25
• 2.6.1 免疫實驗動物24
• 2.6.2 攻毒保護試驗24
• 2.6.3 血清抗體效價的測定24-25
• 3 結果與分析25-35
• 3.1 A型產氣莢膜梭菌外毒素的SDS-PAGE檢測結果25
• 3.2 A型產氣莢膜梭菌外毒素半數致死量測定結果25-26
• 3.3 A型產氣莢膜梭菌外毒素對家兔致死量的測定26
• 3.4 外毒素蛋白濃度的確定26
• 3.5 類毒素疫苗的檢驗26-27
• 3.5.1 穩(wěn)定性檢測26-27
• 3.5.2 甲醛及硫柳汞的檢驗27
• 3.5.3 安全性檢驗27
• 3.6 間接ELISA方法最佳反應條件的確立27-29
• 3.6.1 包被抗原最佳稀釋度的確定27
• 3.6.2 最佳封閉條件的選擇27-28
• 3.6.3 樣品最佳反應時間的確定28
• 3.6.4 酶標二抗孵育時間的確定28
• 3.6.5 顯色底物作用時間的選擇28-29
• 3.6.6 結果判定標準的確定29
• 3.7 間接ELISA方法的性能評價29-30
• 3.7.1 特異性實驗29
• 3.7.2 敏感性實驗29
• 3.7.3 重復性實驗29-30
• 3.8 疫苗保護效果評價結果30-35
• 3.8.1 血清抗體效價測定30-33
• 3.8.2 攻毒保護試驗33-35
• 4 討論35-37
• 4.1 A型產氣莢膜梭菌外毒素的制備和提取35
• 4.2 間接ELISA方法的優(yōu)勢35
• 4.3 間接ELISA方法的實際生產應用35-36
• 4.4 血清抗體消長規(guī)律和攻毒保護試驗結果的研究36-37
• 5 結論37-38
• 參考文獻38-42
• 附錄42-44
• 致謝44

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