發(fā)布時間：2017-08-22 11:10

  本文關(guān)鍵詞：鴨疫里氏桿菌sprT基因缺失突變株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究

  更多相關(guān)文章： 鴨疫里氏桿菌 PorSS sprT 致病性 生物學(xué)特性

【摘要】：鴨疫里氏桿菌病是由鴨疫里氏桿菌引起的鴨、鵝、火雞等多種禽類的一種細(xì)菌性傳染病。血清型眾多、交叉保護(hù)力低、易產(chǎn)生耐藥性使該病難以防控。因此,加強(qiáng)對鴨疫里氏桿菌致病機(jī)制的研究對防制該病具有重要意義。Por分泌系統(tǒng)(Por secretion system,Por SS),也稱為Ⅸ型分泌系統(tǒng)(T9SS)。廣泛分布于擬桿菌門成員中,介導(dǎo)擬桿菌門細(xì)菌的運(yùn)動性及致病機(jī)制。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)RA-YM株基因組存在完整的Por SS系統(tǒng)編碼基因。sprT基因是Por SS系統(tǒng)關(guān)鍵組件。因此,本研究構(gòu)建了RA-YM株sprT基因(RAYM_03924)缺失株,對缺失株生物學(xué)特性開展了研究,具體研究內(nèi)容如下:1、鴨疫里氏桿菌RA-YM株sprT基因缺失株的構(gòu)建與鑒定以RA-YM株基因組為模板,擴(kuò)增sprT基因上、下游同源臂,利用重疊PCR方法將上、下游同源臂與壯觀霉素基因融合,構(gòu)建壯觀霉素抗性基因表達(dá)盒,經(jīng)雙酶切后與p RE-112連接,構(gòu)建自殺性質(zhì)粒p RE-LSR。將構(gòu)建成功的自殺性質(zhì)粒p RE-LSR轉(zhuǎn)化E.coli X7213,以含有p RE-LSR的E.coli X7213為供體菌,以RA-YM株為受體菌,采取雙親本接合轉(zhuǎn)移的方法篩選sprT基因缺失株。挑取在含有壯觀霉素的TSA平板上生長的單菌落,利用雙重PCR鑒定sprT基因缺失突變株,成功構(gòu)建了RA-YM株sprT基因缺失株ΔsprT。2、鴨疫里氏桿菌RA-YM株sprT基因缺失株生物學(xué)特性研究比較了突變株ΔsprT與親本株RA-YM的生長特性和生化特性,結(jié)果顯示ΔsprT在對數(shù)早期的生長速度快于RA-YM,ΔsprT和RA-YM主要生化特性一致,但ΔsprT不能液化明膠。突變株ΔsprT和RA-YM對高鹽耐受濃度一致,均為1.88%。ΔsprT對膽鹽的耐受濃度為23.4μg/m L,RA-YM對膽鹽的耐受濃度為46.9μg/m L。血清抗性試驗(yàn)結(jié)果顯示,突變株ΔsprT在12.5%正常鴨陰性血請的存活率顯著高于RA-YM。對突變株ΔsprT和親本株胞外分泌蛋白的明膠酶譜分析發(fā)現(xiàn),ΔsprT不能夠分泌明膠酶,表明sprT基因缺失導(dǎo)致某些蛋白分泌障礙。3、鴨疫里氏桿菌RA-YM株sprT基因缺失株對雛鴨致病性的研究比較了ΔsprT與RA-YM對10日齡雛鴨的毒力,經(jīng)腿部肌肉注射感染,RA-YM株LD50為3.82×104CFU,ΔsprT株LD50為1.61×109CFU,毒力較親本株下降約4.21×104倍;雛鴨感染試驗(yàn)結(jié)果顯示,在感染后24h,ΔsprT在血液、肝臟、和脾臟的組織載菌量顯著低于RA-YM;在感染后48h,ΔsprT在心臟、肝臟、脾臟和腦的組織載菌量顯著低于RA-YM,表明ΔsprT對組織的侵襲力比親本株下降;病理切片觀察發(fā)現(xiàn),ΔsprT對心臟,肝臟、脾臟和腦組織的病變程度顯著比親本株輕微,表明ΔsprT的致病性較RA-YM顯著下降。本研究發(fā)現(xiàn)sprT基因缺失突變后致其毒力顯著下降,表明通過Por SS系統(tǒng)分泌的因子是鴨疫里氏桿菌重要的毒力因子,值得進(jìn)一步深入研究。
【關(guān)鍵詞】：鴨疫里氏桿菌 PorSS sprT 致病性 生物學(xué)特性
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 縮略詞表10-11
• 1 文獻(xiàn)綜述11-20
• 1.1 鴨疫里氏桿菌病的發(fā)展與現(xiàn)狀11-13
• 1.1.1 形態(tài)及染色11
• 1.1.2 培養(yǎng)及生化特性11
• 1.1.3 血清型11-12
• 1.1.4 流行病學(xué)12
• 1.1.5 臨床病癥12
• 1.1.6 病理剖檢12
• 1.1.7 診斷12
• 1.1.8 防控與治療12-13
• 1.2 鴨疫里氏桿菌毒力相關(guān)因子13-14
• 1.2.1 質(zhì)粒13
• 1.2.2 明膠水解酶13
• 1.2.3 �；铣擅�13-14
• 1.2.4 TonB依賴受體TbdR114
• 1.2.5 二肽肽酶Ⅳ14
• 1.2.6 糖基轉(zhuǎn)移酶14
• 1.2.7 脂蛋白14
• 1.3 革蘭氏陰性菌的分泌系統(tǒng)14-20
• 1.3.1 牙齦卟啉單胞菌PorSS系統(tǒng)16
• 1.3.2 哈氏噬纖維菌PorSS系統(tǒng)16
• 1.3.3 約氏黃桿菌PorSS系統(tǒng)16-18
• 1.3.4 黃褐二氧化碳嗜纖維菌PorSS系統(tǒng)18-19
• 1.3.5 鴨疫里氏桿菌PorSS系統(tǒng)19-20
• 2 目的和意義20-21
• 3 材料與方法21-30
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料21-24
• 3.1.1 菌株、質(zhì)粒以及細(xì)菌的培養(yǎng)條件21
• 3.1.2 工具酶及主要試劑21-22
• 3.1.3 試驗(yàn)動物22
• 3.1.4 培養(yǎng)基、抗生素及其它溶液的配制22-23
• 3.1.5 主要儀器設(shè)備23
• 3.1.6 引物23-24
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法24-30
• 3.2.1 壯觀霉素抗性基因與sprT基因上下游同源臂的克隆24
• 3.2.2 壯觀霉素抗性表達(dá)盒的構(gòu)建與鑒定24-27
• 3.2.3 自殺性質(zhì)粒pRE-LSR的構(gòu)建與鑒定27
• 3.2.4 sprT基因缺失突變株的構(gòu)建及鑒定27
• 3.2.5 sprT基因缺失突變株生物學(xué)特性的研究27-29
• 3.2.6 sprT基因缺失突變株致病性的研究29-30
• 4 結(jié)果與分析30-39
• 4.1 壯觀霉素抗性基因與sprT基因上下游同源臂的擴(kuò)增30
• 4.2 壯觀霉素抗性基因表達(dá)盒的構(gòu)建與鑒定30
• 4.3 自殺性質(zhì)粒pRE-LSR的構(gòu)建及鑒定30-31
• 4.4 sprT基因缺失突變株的構(gòu)建及鑒定31-32
• 4.5 sprT基因缺失突變株生物學(xué)特性的研究32-34
• 4.5.1 sprT基因缺失突變株遺傳穩(wěn)定性32
• 4.5.2 sprT基因缺失突變株生化特性鑒定結(jié)果32-33
• 4.5.3 sprT基因缺失突變株生長曲線的測定33
• 4.5.4 sprT基因缺失突變株抗補(bǔ)體能力的測定33-34
• 4.5.5 sprT基因缺失突變株在高鹽狀態(tài)的生長特性34
• 4.5.6 sprT基因缺失突變株膽鹽耐受能力的測定34
• 4.5.7 sprT基因缺失突變株明膠酶譜試驗(yàn)34
• 4.6 鴨疫里氏桿菌sprT基因缺失突變株致病性的研究34-39
• 4.6.1 鴨疫里氏桿菌sprT基因缺失突變株LD50的測定34-35
• 4.6.2 sprT基因缺失突變株組織載菌量的測定35-36
• 4.6.3 sprT基因缺失突變株病理組織學(xué)觀察36-39
• 5 討論39-41
• 5.1 鴨疫里氏桿菌sprT基因缺失突變株生物學(xué)特性的研究39
• 5.2 鴨疫里氏桿菌毒力的研究39-40
• 5.3 對sprT基因缺失突變株后續(xù)工作的展望40-41
• 6 結(jié)論41-42
• 參考文獻(xiàn)42-46
• 致謝46

【相似文獻(xiàn)】

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