本文關(guān)鍵詞：豬細小病毒基因組序列分析與滅活疫苗的制備及免疫效果評價

  更多相關(guān)文章： 豬細小病毒 序列分析 滅活疫苗 免疫

【摘要】：豬細小病毒病(Porcine parvovirus infection,PPI)又稱豬的繁殖障礙病,是由豬細小病毒(Porcine parvovirus,PPV)引起的一種豬的繁殖障礙病。豬是唯一的易感動物。PPV主要感染妊娠前期的母豬,引起母豬流產(chǎn)、胚胎死亡、胎兒畸形、木乃伊化、弱胎及不孕等危害,給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大損失。因此,控制PPI對養(yǎng)豬業(yè)具有十分重要的意義。本研究對經(jīng)PCR進行擴增的PPV核酸陽性的病料進行處理后,在豬睪丸(Swine testicular cells,ST)細胞上進行病毒分離,獲得1株P(guān)PV,命名為PPVGD。對獲得的PPVGD分離株進行了病毒的耐脂溶劑、耐酸、耐熱及耐胰酶的理化特性鑒定,這些特性與PPV相符。根據(jù)GenBank上已公布的PPV序列,設(shè)計合成引物,對PPVGD分離株基因組進行PCR擴增并進行序列測定,獲得包含全部編碼區(qū)4251 bp的基因組序列。將PPVGD分離株與GenBank公布的44株P(guān)PV參考毒株NS1基因和55株P(guān)PV參考毒株的VP2基因的核苷酸序列、氨基酸序列分別進行比對分析,并繪制進化樹。核苷酸序列相似性分析表明:PPVGD分離株的NS1基因的核苷酸序列與中國分離株HN-G、HN-H、HN-K的相似性最高,為99.9%,與33760005-3a株的相似性最低,為98.2%。PPVGD分離株的VP2基因的核苷酸序列與美國經(jīng)典株NADL-2和POVNADL-2的相似性最高,為99.7%,與15425株最低,為98.1%。氨基酸序列相似性分析表明,PPVGD分離株的NS1基因的氨基酸序列與中國分離株HN-G、HN-K、J-PPV和NJ及美國毒株NADL-2、POVNADL-2和Kresse的相似性最高,為99.7%;與33760005-3a株的相似性最低,為98.0%。PPVGD分離株的VP2基因的氨基酸序列與中國分離株HN-I和美國毒株NADL-2和POVNADL-2的相似性最高,為99.0%;與WB-773和21620005-1h株的相似性最低,為96.4%。本研究將PPVGD分離株在ST細胞上增殖,并對病毒增殖條件進行了優(yōu)化,獲得了大量的病毒液,為疫苗的制備奠定了基礎(chǔ)。培養(yǎng)的PPVGD病毒液的血凝效價可達1:29。利用獲得的病毒液,按照中國生物制品規(guī)程制備了PPV分離株的油乳劑滅活疫苗。制備的PPVGD滅活疫苗分別免疫350 g左右健康豚鼠和4月齡左右的后備母豬。豚鼠免疫28 d后采血、后備母豬免疫14 d后、28 d后分別采血。后備母豬28 d時加強免疫一次,加強免疫14 d后再采血,對免疫動物的血清分別進行血凝抗體效價的測定。結(jié)果表明,豚鼠和后備母豬免疫28 d后的HI抗體效價均達1:26以上,表明該疫苗具有良好的免疫原性。并且免疫PPVGD滅活疫苗后,均無不良反應(yīng),表明疫苗的安全性好,為疫苗的進一步研制奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：豬細小病毒 序列分析 滅活疫苗 免疫
【學位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.28
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 本論文常用縮寫詞7-12
• 1 前言12-23
• 1.1 豬細小病毒的概述12
• 1.2 豬細小病毒流行病學12-13
• 1.3 PPV的分子生物學特點13-15
• 1.3.1 基因組結(jié)構(gòu)與主要編碼蛋白13-14
• 1.3.2 PPV復(fù)制和轉(zhuǎn)錄特點14-15
• 1.4 PPV病原學15-16
• 1.4.1 PPV的理化特性15
• 1.4.2 PPV的血凝性15
• 1.4.3 PPV的致病性及臨床表現(xiàn)型15-16
• 1.5 PPV的診斷方法16-18
• 1.5.1 PPV的分離培養(yǎng)16
• 1.5.2 血清學方法16-18
• 1.6 分子生物學方法18-19
• 1.6.1 PCR檢測技術(shù)18-19
• 1.6.2 核酸探針技術(shù)19
• 1.7 PPV疫苗概況19-22
• 1.7.1 PPV滅活疫苗19-20
• 1.7.2 PPV弱毒疫苗20-21
• 1.7.3 其他新型疫苗21-22
• 1.8 本論文研究的目的與意義22-23
• 2 材料與方法23-41
• 2.1 材料23-25
• 2.1.1 菌株、毒株和細胞23
• 2.1.2 主要酶類及其它相關(guān)試劑23
• 2.1.3 常用溶液的配制23-24
• 2.1.4 細菌培養(yǎng)基配制24-25
• 2.1.5 主要儀器及設(shè)備25
• 2.1.6 實驗動物25
• 2.2 方法25-41
• 2.2.1 PPV的分離與鑒定25-28
• 2.2.2 PPVGD分離株基因組的擴增28-33
• 2.2.3 各基因序列的拼接及分析33-35
• 2.2.4 PPVGD分離株的培養(yǎng)35-38
• 2.2.5 病毒無菌檢驗38
• 2.2.6 PPVGD分離株的滅活38
• 2.2.7 PPVGD滅活效果的檢測38
• 2.2.8 PPVGD分離株滅活疫苗的制備38-39
• 2.2.9 PPVGD滅活疫苗的質(zhì)量檢測39
• 2.2.10 PPVGD滅活疫苗免疫效果的評價39-41
• 3 結(jié)果與分析41-54
• 3.1 PPV的分離與鑒定41
• 3.2 PPV分離培養(yǎng)及理化鑒定41-42
• 3.2.1 PPVGD分離株細胞病變觀察41-42
• 3.2.2 PPVGD 分離株血凝效價的測定42
• 3.3 PPVGD分離株的理化學性質(zhì)鑒定42
• 3.4 PPVGD分離株基因組各片段克隆42-49
• 3.4.1 基因擴增42-43
• 3.4.2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定43
• 3.4.3 PPV分離株各基因測序結(jié)果及序列拼接43-44
• 3.4.4 PPVGD分離株和參考毒株的NS1核苷酸和氨基酸同源性比較44-46
• 3.4.5 PPVGD分離株和參考毒株的VP2核苷酸和氨基酸同源性比較46-49
• 3.4.6 PPVGD株遺傳進化關(guān)系分析49
• 3.5 PPVGD分離株培養(yǎng)條件優(yōu)化49-51
• 3.5.1 細胞培養(yǎng)液NCS濃度的確定49-50
• 3.5.2 維持液NCS濃度的確定50
• 3.5.3 接毒時細胞密度的確定50
• 3.5.4 細胞接毒劑量的確定50-51
• 3.5.5 收毒時間確定51
• 3.6 PPVGD滅活疫苗的制備51-52
• 3.6.1 PPVGD分離株血凝效價的測定51
• 3.6.2 PPVGD滅活效果的檢測51
• 3.6.3 PPVGD滅活疫苗質(zhì)量的檢測51-52
• 3.7 PPVGD滅活疫苗免疫效果的評價52-54
• 3.7.1 豚鼠-動物模型52-53
• 3.7.2 豬-動物模型53-54
• 4 討論54-59
• 4.1 PPV分離株基因組序列分析54-55
• 4.2 PPVGD分離株的增殖培養(yǎng)55-56
• 4.3 PPV滴度測定56-57
• 4.4 PPVGD滅活疫苗的制備57-58
• 4.5 抗體檢測58-59
• 全文總結(jié)59-60
• 致謝60-61
• 參考文獻61-65
• 附錄65-71

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 仇錚;任曉峰;崔尚金;;豬細小病毒的致病機制與防控策略[J];世界華人消化雜志;2013年01期

2 鄂美聰;;豬細小病毒病的特點與防治[J];中國畜牧獸醫(yī)文摘;2012年10期

3 尹子靜;;國內(nèi)豬細小病毒疫苗及免疫程序[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2011年08期

4 劉占通;王書麗;;豬細小病毒研究進展[J];上海畜牧獸醫(yī)通訊;2011年04期

5 王芳;袁海霞;傅衍;;豬細小病毒分子生物學研究進展[J];生物學雜志;2011年01期

6 張俊紅;李國輝;陳慧卿;黃國平;姚勤;;細小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1功能的研究進展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學;2010年22期

7 甄洪花;沈志強;單虎;王金良;付石軍;張松林;;豬細小病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2研究進展[J];動物醫(yī)學進展;2009年08期

8 黃賢波;余旭平;金江烽;;豬細小病毒的研究進展[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2008年11期

9 李國強;鐘晶輝;楊志元;呼榮建;;豬細小病毒的研究與防治[J];吉林畜牧獸醫(yī);2008年05期

10 魏戰(zhàn)勇;王學斌;崔保安;黃克和;金喜新;王亞賓;陳紅英;;豬細小病毒核酸疫苗的構(gòu)建及其對小鼠免疫原性的研究[J];中國生物工程雜志;2006年12期

，

本文編號：714764