本文關鍵詞：褪黑素對水牛卵母細胞體外成熟的影響及其機制的探究

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【摘要】：褪黑素是松果腺分泌的一種多功能分子,它不僅能調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律和季節(jié)性動物繁殖,而且在調(diào)節(jié)動物生殖方面也起著重要的作用。研究證明,褪黑素對卵泡的發(fā)育、卵母細胞的成熟和胚胎發(fā)育起著重要的作用。本研究主要是探討外源性褪黑素對水牛卵母細胞體外成熟的影響,并對其相關作用機制進行探究,以期進一步優(yōu)化卵母細胞體外成熟的培養(yǎng)體系,為闡明水牛卵母細胞成熟的機制提供一定的理論依據(jù)。首先,檢測了水牛卵丘細胞和卵母細胞上褪黑素的兩種受體MT1和MT2的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在水牛卵丘細胞和卵母細胞上均存在褪黑素受體MT1和MT2。其次,探究了在體外成熟培養(yǎng)液中添加不同濃度褪黑素(0M、10-9M、10-8M、10-7M)對水牛卵母細胞體外成熟及其隨后體外受精胚胎的發(fā)育的影響。結(jié)果顯示：水牛卵母細胞在添加不同濃度的褪黑素(10-9M、10-8M、10-7M)的成熟液中成熟培養(yǎng)22-24h后,每個處理組的卵母細胞第一極體排出率均顯著高于未添加組(50.30% vs 47.56%、53.04% vs 47.56%、50.63% vs47.56%,P0.05),且濃度為10-8M組卵母細胞的極體排出率顯著高于10-9M和10-7M組(P0.05)。隨后,將各組成熟培養(yǎng)24 h后的卵母細胞進行體外受精,發(fā)現(xiàn)受精后各處理組胚胎的分裂率顯著高于未添加組(60.23% vs57.62%、65.26% vs 57.62%、62.84% vs 57.62%,P0.05),而且10-8M和10-7M組的胚胎能發(fā)育到囊胚的比例顯著高于未添加組(20.48% vs15.22%、18.68 vs 15.22%,P0.05),但10-9M組的囊胚發(fā)育率與未添加組相比差異不顯著(16.44% vs 15.22%,P0.05)。最后,探討了褪黑素對卵母細胞成熟影響的作用機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在成熟液中單獨添加同等濃度的褪黑素受體拮抗劑(LZU,10-8M),水牛卵母細胞成熟培養(yǎng)后的極體排出率(47.44% vs 48.15%)、體外受精后胚胎分裂率(57.18% vs 58.42%)和囊胚率(15.06% vs 15.26%)與未添加組相比,差異不顯著(P0.05)；而單獨添加同等濃度的褪黑素受體激動劑(IIK7,10-8M)時,水牛卵母細胞成熟培養(yǎng)后的極體排出率(51.25% vs 48.15%)、體外受精后胚胎分裂率(64.15% vs 58.42%)和囊胚率(19.04% vs 15.26%)均顯著高于未添加組(P0.05),但與單獨添加褪黑素組(MT,10-8M)卵母細胞的極體排出率(51.25% vs 52.94%)、體外受精后胚胎的分裂率(61.24% vs 64.32%)和囊胚率(18.52% vs 19.36%)相比,差異不顯著(P0.05)；當同時添加褪黑素(MT,10-8M)和褪黑素受體拮抗劑(LZU，，10-8M)時,水牛卵母細胞成熟后的極體排出率(48.19% vs 48.15%)、體外受精后胚胎的分裂率(58.13% vs 58.42%)和囊胚率(15.23% vs 15.26%)與未添加組相比,差異不顯著(P0.05)。對卵母細胞活性氧進行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)褪黑素處理組卵母細胞成熟后細胞內(nèi)的活性氧含量顯著低于未添加的對照組(P0.05)。利用激光共聚焦顯微鏡檢測卵母細胞線粒體的分布和線粒體膜電位的變化情況,結(jié)果顯示：褪黑素處組水牛卵母細胞線粒體呈擴散型分布的數(shù)量及線粒體的膜電位均顯著高于未添加組(P0.05)。利用酶標檢測cAMP、cGMP、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶含量的變化,發(fā)現(xiàn)褪黑素處理組的卵母細胞內(nèi)cAMP的含量顯著低于未添加組,而cGMP、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶的含量顯著高于未添加組(P0.05)。熒光定量PCR檢測抗氧化基因GPX4和SOD1、卵丘擴展相關基因PTX3 和 HAS1、HAS2以及褪黑素受體基因MT1和MT2的表達情況,結(jié)果顯示：經(jīng)褪黑素處理能顯著上調(diào)水牛卵母細胞GPX4、SOD1、MT1和MT2的表達,而且也顯著上調(diào)了卵丘細胞上卵丘擴展相關基因PTX、HAS1、HAS2以及褪黑素受體基因MT1和MT2的表達水平(P0.05)。上述結(jié)果表明：(1)在水牛卵丘細胞和卵母細胞上均存在褪黑素受體MT1和MT2;(2)在水牛成熟液中添加適當濃度(10-8M)的褪黑素有利于水牛卵母細胞體外成熟以及其胚胎發(fā)育潛能的獲得；(3)褪黑素能抑制卵母細胞cAMP的合成、促進卵母細胞cGMP的合成,同時上調(diào)卵丘擴展相關基因PTX、HAS1、HAS2口上調(diào)受體基因MT1、MT2的表達；(4)褪黑素能促進卵母細胞中抗氧化物酶的合成,清除細胞活性氧,并上調(diào)抗氧化物酶的基因表達。
【關鍵詞】：水牛卵母細胞 體外成熟 褪黑素 受體 作用機制
【學位授予單位】：廣西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S823.83
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-14
• 第一部分 文獻綜述14-32
• 1 哺乳動物卵母細胞體外成熟的研究進展15-25
• 1.1 前言15
• 1.2 卵子的發(fā)生的過程15-18
• 1.2.1 卵原細胞的形成和增殖15-16
• 1.2.2 卵母細胞的形成和生長16
• 1.2.3 卵母細胞的成熟16-17
• 1.2.4 卵母細胞的成熟調(diào)控17-18
• 1.3 卵母細胞的體外成熟18-22
• 1.3.1 卵母細胞的采集方法19-20
• 1.3.2 卵母細胞的體外成熟質(zhì)量的評定20
• 1.3.3 卵母細胞體外成熟的方法20-22
• 1.4 影響卵母細胞體外成熟的因素22-25
• 1.4.1 動物的種類22
• 1.4.2 動物的年齡22
• 1.4.3 動物的生產(chǎn)性能22
• 1.4.4 卵母細胞的形態(tài)和類型22-23
• 1.4.5 卵泡的大小和形態(tài)23
• 1.4.6 卵丘細胞23
• 1.4.7 顆粒細胞23-24
• 1.4.8 卵巢貯存溫度和時間24
• 1.4.9 激素24-25
• 2 褪黑素的研究進展25-31
• 2.1 褪黑素簡介25-26
• 2.2 褪黑素的合成26
• 2.3 褪黑素的功能簡介26-28
• 2.4 褪黑素對顆粒細胞的影響28
• 2.5 褪黑素對卵母細胞體外培養(yǎng)的影響28-29
• 2.6 褪黑素對胚胎體外培養(yǎng)的影響29
• 2.7 褪黑素對線粒體的影響29-30
• 2.8 褪黑素的作用機制和受體的信號通路30-31
• 3 目的與意義31-32
• 第二部分 試驗研究32-62
• 第一章 褪黑素對水牛卵母細胞體外成熟和胚胎體外發(fā)育的影響33-43
• 1 材料與方法34-38
• 1.1 材料34-35
• 1.1.1 組織材料34
• 1.1.2 主要儀器設備34
• 1.1.3 主要試劑34
• 1.1.4 主要溶液的配制34-35
• 1.2 試驗方法35-37
• 1.2.1 水牛卵母細胞的收集及體外成熟培養(yǎng)35-36
• 1.2.2 水牛卵母細胞的體外受精(IVF)36
• 1.2.3 水牛早期胚胎體外培養(yǎng)(IVC)36-37
• 1.2.4 水牛COCs和水牛卵母細胞免疫熒光染色37
• 1.3 試驗設計37
• 1.4 數(shù)據(jù)處理分析37-38
• 2 結(jié)果38-40
• 2.1 褪黑素受體在卵丘細胞和卵母細胞上的表達分析38-39
• 2.2 成熟液中添加不同濃度褪黑素對水牛卵母細胞體外成熟的影響39-40
• 2.3 成熟液中添加不同濃度褪黑素對水牛卵母細胞后續(xù)胚胎發(fā)育能力的影響40
• 3 分析與討論40-42
• 4 小結(jié)42-43
• 第二章 褪黑素對水牛卵母細胞體外成熟作用機制的探究43-62
• 1 材料與方法44-50
• 1.1 材料44-46
• 1.1.1 組織材料44
• 1.1.2 主要儀器設備44
• 1.1.3 主要試劑44
• 1.1.4 主要溶液的配制44-46
• 1.1.5 引物合成46
• 1.2 試驗方法46-49
• 1.2.1 水牛COCs的收集與體外成熟培養(yǎng)46
• 1.2.2 水牛卵母細胞的體外受精(IVF)46
• 1.2.3 水牛早期胚胎體外培養(yǎng)(IVC)46-47
• 1.2.4 水牛卵母細胞成熟前后活性氧的檢測47
• 1.2.5 水牛卵母細胞成熟前后線粒體膜電位和線粒體分布檢測47
• 1.2.6 水牛卵母細胞成熟前后cAMP、cGMP和抗氧化物酶的檢測47-48
• 1.2.7 水牛顆粒細胞的收集及基因組的提取和反轉(zhuǎn)錄48
• 1.2.8 水牛卵母細胞的微量反轉(zhuǎn)48-49
• 1.2.9 實時熒光定量PCR49
• 1.3 試驗設計49-50
• 1.4 統(tǒng)計分析50
• 2 結(jié)果50-58
• 2.1 褪黑素受體拮抗劑、褪黑素受體激動劑和褪黑素對水牛卵母細胞體外成熟的影響50-51
• 2.2 褪黑素受體拮抗劑、褪黑素受體激動劑和褪黑素對水牛卵母細胞體外成熟受精后胚胎發(fā)育能力的影響51-52
• 2.3 褪黑素對水牛卵母細胞成熟后活性氧含量的影響52-53
• 2.4 褪黑素對水牛卵母細胞成熟后線粒體分布和線粒體膜電位的影響53-55
• 2.4.1 褪黑素對水牛卵母細胞成熟后線粒體分布的影響53-54
• 2.4.2 褪黑素對水牛卵母細胞成熟后線粒體膜電位的影響54-55
• 2.5 褪黑素對水牛卵母細胞成熟后cAMP和cGMP含量的影響55-56
• 2.6 褪黑素對水牛卵母細胞成熟后過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶含量的影響56
• 2.7 褪黑素對水牛卵母細胞成熟后相關基因MRNA表達量的影響56-58
• 3 分析與討論58-61
• 4 小結(jié)61-62
• 全文結(jié)論62-63
• 參考文獻63-68
• 英文縮略詞68-69
• 致謝69-70

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