本文關(guān)鍵詞：褪黑素對(duì)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響及其機(jī)制的探究

  更多相關(guān)文章： 水牛卵母細(xì)胞 體外成熟 褪黑素 受體 作用機(jī)制

【摘要】：褪黑素是松果腺分泌的一種多功能分子,它不僅能調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律和季節(jié)性動(dòng)物繁殖,而且在調(diào)節(jié)動(dòng)物生殖方面也起著重要的作用。研究證明,褪黑素對(duì)卵泡的發(fā)育、卵母細(xì)胞的成熟和胚胎發(fā)育起著重要的作用。本研究主要是探討外源性褪黑素對(duì)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響,并對(duì)其相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行探究,以期進(jìn)一步優(yōu)化卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)體系,為闡明水牛卵母細(xì)胞成熟的機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。首先,檢測(cè)了水牛卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞上褪黑素的兩種受體MT1和MT2的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在水牛卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞上均存在褪黑素受體MT1和MT2。其次,探究了在體外成熟培養(yǎng)液中添加不同濃度褪黑素(0M、10-9M、10-8M、10-7M)對(duì)水牛卵母細(xì)胞體外成熟及其隨后體外受精胚胎的發(fā)育的影響。結(jié)果顯示：水牛卵母細(xì)胞在添加不同濃度的褪黑素(10-9M、10-8M、10-7M)的成熟液中成熟培養(yǎng)22-24h后,每個(gè)處理組的卵母細(xì)胞第一極體排出率均顯著高于未添加組(50.30% vs 47.56%、53.04% vs 47.56%、50.63% vs47.56%,P0.05),且濃度為10-8M組卵母細(xì)胞的極體排出率顯著高于10-9M和10-7M組(P0.05)。隨后,將各組成熟培養(yǎng)24 h后的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精,發(fā)現(xiàn)受精后各處理組胚胎的分裂率顯著高于未添加組(60.23% vs57.62%、65.26% vs 57.62%、62.84% vs 57.62%,P0.05),而且10-8M和10-7M組的胚胎能發(fā)育到囊胚的比例顯著高于未添加組(20.48% vs15.22%、18.68 vs 15.22%,P0.05),但10-9M組的囊胚發(fā)育率與未添加組相比差異不顯著(16.44% vs 15.22%,P0.05)。最后,探討了褪黑素對(duì)卵母細(xì)胞成熟影響的作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在成熟液中單獨(dú)添加同等濃度的褪黑素受體拮抗劑(LZU,10-8M),水牛卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)后的極體排出率(47.44% vs 48.15%)、體外受精后胚胎分裂率(57.18% vs 58.42%)和囊胚率(15.06% vs 15.26%)與未添加組相比,差異不顯著(P0.05)；而單獨(dú)添加同等濃度的褪黑素受體激動(dòng)劑(IIK7,10-8M)時(shí),水牛卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)后的極體排出率(51.25% vs 48.15%)、體外受精后胚胎分裂率(64.15% vs 58.42%)和囊胚率(19.04% vs 15.26%)均顯著高于未添加組(P0.05),但與單獨(dú)添加褪黑素組(MT,10-8M)卵母細(xì)胞的極體排出率(51.25% vs 52.94%)、體外受精后胚胎的分裂率(61.24% vs 64.32%)和囊胚率(18.52% vs 19.36%)相比,差異不顯著(P0.05)；當(dāng)同時(shí)添加褪黑素(MT,10-8M)和褪黑素受體拮抗劑(LZU，，10-8M)時(shí),水牛卵母細(xì)胞成熟后的極體排出率(48.19% vs 48.15%)、體外受精后胚胎的分裂率(58.13% vs 58.42%)和囊胚率(15.23% vs 15.26%)與未添加組相比,差異不顯著(P0.05)。對(duì)卵母細(xì)胞活性氧進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)褪黑素處理組卵母細(xì)胞成熟后細(xì)胞內(nèi)的活性氧含量顯著低于未添加的對(duì)照組(P0.05)。利用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)卵母細(xì)胞線粒體的分布和線粒體膜電位的變化情況,結(jié)果顯示：褪黑素處組水牛卵母細(xì)胞線粒體呈擴(kuò)散型分布的數(shù)量及線粒體的膜電位均顯著高于未添加組(P0.05)。利用酶標(biāo)檢測(cè)cAMP、cGMP、過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶含量的變化,發(fā)現(xiàn)褪黑素處理組的卵母細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量顯著低于未添加組,而cGMP、過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的含量顯著高于未添加組(P0.05)。熒光定量PCR檢測(cè)抗氧化基因GPX4和SOD1、卵丘擴(kuò)展相關(guān)基因PTX3 和 HAS1、HAS2以及褪黑素受體基因MT1和MT2的表達(dá)情況,結(jié)果顯示：經(jīng)褪黑素處理能顯著上調(diào)水牛卵母細(xì)胞GPX4、SOD1、MT1和MT2的表達(dá),而且也顯著上調(diào)了卵丘細(xì)胞上卵丘擴(kuò)展相關(guān)基因PTX、HAS1、HAS2以及褪黑素受體基因MT1和MT2的表達(dá)水平(P0.05)。上述結(jié)果表明：(1)在水牛卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞上均存在褪黑素受體MT1和MT2;(2)在水牛成熟液中添加適當(dāng)濃度(10-8M)的褪黑素有利于水牛卵母細(xì)胞體外成熟以及其胚胎發(fā)育潛能的獲得；(3)褪黑素能抑制卵母細(xì)胞cAMP的合成、促進(jìn)卵母細(xì)胞cGMP的合成,同時(shí)上調(diào)卵丘擴(kuò)展相關(guān)基因PTX、HAS1、HAS2口上調(diào)受體基因MT1、MT2的表達(dá)；(4)褪黑素能促進(jìn)卵母細(xì)胞中抗氧化物酶的合成,清除細(xì)胞活性氧,并上調(diào)抗氧化物酶的基因表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：水牛卵母細(xì)胞 體外成熟 褪黑素 受體 作用機(jī)制
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S823.83
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-14
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述14-32
• 1 哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟的研究進(jìn)展15-25
• 1.1 前言15
• 1.2 卵子的發(fā)生的過(guò)程15-18
• 1.2.1 卵原細(xì)胞的形成和增殖15-16
• 1.2.2 卵母細(xì)胞的形成和生長(zhǎng)16
• 1.2.3 卵母細(xì)胞的成熟16-17
• 1.2.4 卵母細(xì)胞的成熟調(diào)控17-18
• 1.3 卵母細(xì)胞的體外成熟18-22
• 1.3.1 卵母細(xì)胞的采集方法19-20
• 1.3.2 卵母細(xì)胞的體外成熟質(zhì)量的評(píng)定20
• 1.3.3 卵母細(xì)胞體外成熟的方法20-22
• 1.4 影響卵母細(xì)胞體外成熟的因素22-25
• 1.4.1 動(dòng)物的種類22
• 1.4.2 動(dòng)物的年齡22
• 1.4.3 動(dòng)物的生產(chǎn)性能22
• 1.4.4 卵母細(xì)胞的形態(tài)和類型22-23
• 1.4.5 卵泡的大小和形態(tài)23
• 1.4.6 卵丘細(xì)胞23
• 1.4.7 顆粒細(xì)胞23-24
• 1.4.8 卵巢貯存溫度和時(shí)間24
• 1.4.9 激素24-25
• 2 褪黑素的研究進(jìn)展25-31
• 2.1 褪黑素簡(jiǎn)介25-26
• 2.2 褪黑素的合成26
• 2.3 褪黑素的功能簡(jiǎn)介26-28
• 2.4 褪黑素對(duì)顆粒細(xì)胞的影響28
• 2.5 褪黑素對(duì)卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響28-29
• 2.6 褪黑素對(duì)胚胎體外培養(yǎng)的影響29
• 2.7 褪黑素對(duì)線粒體的影響29-30
• 2.8 褪黑素的作用機(jī)制和受體的信號(hào)通路30-31
• 3 目的與意義31-32
• 第二部分 試驗(yàn)研究32-62
• 第一章 褪黑素對(duì)水牛卵母細(xì)胞體外成熟和胚胎體外發(fā)育的影響33-43
• 1 材料與方法34-38
• 1.1 材料34-35
• 1.1.1 組織材料34
• 1.1.2 主要儀器設(shè)備34
• 1.1.3 主要試劑34
• 1.1.4 主要溶液的配制34-35
• 1.2 試驗(yàn)方法35-37
• 1.2.1 水牛卵母細(xì)胞的收集及體外成熟培養(yǎng)35-36
• 1.2.2 水牛卵母細(xì)胞的體外受精(IVF)36
• 1.2.3 水牛早期胚胎體外培養(yǎng)(IVC)36-37
• 1.2.4 水牛COCs和水牛卵母細(xì)胞免疫熒光染色37
• 1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)37
• 1.4 數(shù)據(jù)處理分析37-38
• 2 結(jié)果38-40
• 2.1 褪黑素受體在卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞上的表達(dá)分析38-39
• 2.2 成熟液中添加不同濃度褪黑素對(duì)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響39-40
• 2.3 成熟液中添加不同濃度褪黑素對(duì)水牛卵母細(xì)胞后續(xù)胚胎發(fā)育能力的影響40
• 3 分析與討論40-42
• 4 小結(jié)42-43
• 第二章 褪黑素對(duì)水牛卵母細(xì)胞體外成熟作用機(jī)制的探究43-62
• 1 材料與方法44-50
• 1.1 材料44-46
• 1.1.1 組織材料44
• 1.1.2 主要儀器設(shè)備44
• 1.1.3 主要試劑44
• 1.1.4 主要溶液的配制44-46
• 1.1.5 引物合成46
• 1.2 試驗(yàn)方法46-49
• 1.2.1 水牛COCs的收集與體外成熟培養(yǎng)46
• 1.2.2 水牛卵母細(xì)胞的體外受精(IVF)46
• 1.2.3 水牛早期胚胎體外培養(yǎng)(IVC)46-47
• 1.2.4 水牛卵母細(xì)胞成熟前后活性氧的檢測(cè)47
• 1.2.5 水牛卵母細(xì)胞成熟前后線粒體膜電位和線粒體分布檢測(cè)47
• 1.2.6 水牛卵母細(xì)胞成熟前后cAMP、cGMP和抗氧化物酶的檢測(cè)47-48
• 1.2.7 水牛顆粒細(xì)胞的收集及基因組的提取和反轉(zhuǎn)錄48
• 1.2.8 水牛卵母細(xì)胞的微量反轉(zhuǎn)48-49
• 1.2.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR49
• 1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)49-50
• 1.4 統(tǒng)計(jì)分析50
• 2 結(jié)果50-58
• 2.1 褪黑素受體拮抗劑、褪黑素受體激動(dòng)劑和褪黑素對(duì)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響50-51
• 2.2 褪黑素受體拮抗劑、褪黑素受體激動(dòng)劑和褪黑素對(duì)水牛卵母細(xì)胞體外成熟受精后胚胎發(fā)育能力的影響51-52
• 2.3 褪黑素對(duì)水牛卵母細(xì)胞成熟后活性氧含量的影響52-53
• 2.4 褪黑素對(duì)水牛卵母細(xì)胞成熟后線粒體分布和線粒體膜電位的影響53-55
• 2.4.1 褪黑素對(duì)水牛卵母細(xì)胞成熟后線粒體分布的影響53-54
• 2.4.2 褪黑素對(duì)水牛卵母細(xì)胞成熟后線粒體膜電位的影響54-55
• 2.5 褪黑素對(duì)水牛卵母細(xì)胞成熟后cAMP和cGMP含量的影響55-56
• 2.6 褪黑素對(duì)水牛卵母細(xì)胞成熟后過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶含量的影響56
• 2.7 褪黑素對(duì)水牛卵母細(xì)胞成熟后相關(guān)基因MRNA表達(dá)量的影響56-58
• 3 分析與討論58-61
• 4 小結(jié)61-62
• 全文結(jié)論62-63
• 參考文獻(xiàn)63-68
• 英文縮略詞68-69
• 致謝69-70

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5 胡奇珍;褪黑素抑制酒精性脂肪肝的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

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7 張笑哲;褪黑素對(duì)氧化應(yīng)激條件下ARPE-19細(xì)胞與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)體系的作用研究及機(jī)制探討[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

8 肖志勇;新型褪黑素受體激動(dòng)劑Neu-240改善帕金森模型大小鼠運(yùn)動(dòng)功能損傷[D];南華大學(xué);2015年

9 胡春利;褪黑素通過(guò)Reelin信號(hào)通路對(duì)Aβ_(1-42)介導(dǎo)的神經(jīng)退行性變的保護(hù)作用[D];遼寧醫(yī)學(xué)院;2015年

10 李偉;外源褪黑素對(duì)超低溫冷凍小鼠成熟卵母細(xì)胞發(fā)育潛力的影響[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

本文編號(hào)：709158