本文關(guān)鍵詞：豬瘟病毒非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)功能研究

  更多相關(guān)文章： 豬瘟 豬瘟病毒 非編碼區(qū) ARE結(jié)構(gòu)域 HuR蛋白

【摘要】：豬瘟(Classical swine fever,CSF)是一種高傳染性、高致病性和高致死率的病毒性傳染病,危害豬和野豬。豬瘟因其發(fā)病特點(diǎn),給許多國家的養(yǎng)豬業(yè)都造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失,因此豬瘟被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為A類法定傳染病。豬瘟是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一種病毒性傳染病,該病毒是黃病毒科、瘟病毒屬的一員。CSFV是一種單股正鏈的RNA病毒,外層有囊膜結(jié)構(gòu),病毒粒子直徑為40~60 nm,其基因組大小約為12.3 kb。CSFV基因組結(jié)構(gòu)主要由三部分組成,依次為5’非編碼區(qū)(5’untranslated region,5’UTR)、能夠編碼約3900個(gè)氨基酸殘基的多聚蛋白的開放閱讀框(ORF)和3’非編碼區(qū)(3’untranslated region,3’UTR)。其中,5’UTR和3’UTR在病毒基因組RNA復(fù)制和翻譯中都起到了重要的作用。將CSFV強(qiáng)毒株Shimen株和弱毒株HCLV進(jìn)行序列比對,發(fā)現(xiàn)弱毒株HCLV在3’UTR的58到69位點(diǎn)之間插入了12個(gè)核苷酸序列,這是造成CSFV毒力強(qiáng)弱的一個(gè)重要因素。在本實(shí)驗(yàn)中,用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)進(jìn)行CSFV非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)功能的研究。分別構(gòu)建了Shimen株和HCLV株的5’UTR和3’UTR調(diào)節(jié)的熒光素酶表達(dá)載體,并進(jìn)行比對分析。結(jié)果顯示,弱毒株HCLV的5’UTR和3’UTR對熒光素酶表達(dá)抑制作用不及強(qiáng)毒株Shimen,說明CSFV毒性的強(qiáng)弱確實(shí)與非編碼區(qū)相關(guān)。為了研究CSFV 3’UTR在調(diào)節(jié)豬瘟病毒翻譯過程中的作用機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)對3’UTR進(jìn)行了一系列的截短研究。發(fā)現(xiàn)其抑制翻譯作用的區(qū)域主要位于核苷酸80-106區(qū)間,該區(qū)域富含AU,即ARE結(jié)構(gòu)域。通過生物信息技術(shù)分析發(fā)現(xiàn),在ARE下游的112-139位點(diǎn)有潛在的microRNA ssc-let-7結(jié)合處。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,單獨(dú)的ssc-let-7結(jié)合區(qū)不能對3’UTR產(chǎn)生明顯的抑制作用,但ARE-let7對3’UTR的抑制效果會(huì)顯著增強(qiáng),說明ssc-let-7可能只有在ARE存在的情況下,才能有協(xié)同抑制豬瘟病毒翻譯的作用。由于ARE缺失會(huì)增強(qiáng)3’UTR的抑制作用,暗示宿主細(xì)胞中有些蛋白結(jié)合于此處調(diào)節(jié)豬瘟病毒的翻譯,降低ARE區(qū)對病毒翻譯的抑制。本研究表明HuR就是這樣一種蛋白。當(dāng)HuR蛋白過表達(dá)時(shí),ARE對翻譯的抑制效果明顯減弱。反之,當(dāng)把HuR蛋白干涉后,發(fā)現(xiàn)ARE對熒光素酶的表達(dá)的抑制作用增強(qiáng)。由此可知,宿主細(xì)胞中的HuR與CSFV3’UTR區(qū)的ARE結(jié)合后,能增強(qiáng)CSFV的翻譯作用�？傊�,豬瘟病毒3’UTR能抑制其在宿主細(xì)胞中的翻譯,而且ARE區(qū)在其調(diào)節(jié)病毒的翻譯過程中起著最主要的作用。豬瘟病毒也能雇傭一些宿主細(xì)胞的蛋白,如HuR來調(diào)節(jié)其蛋白的翻譯。
【關(guān)鍵詞】：豬瘟 豬瘟病毒 非編碼區(qū) ARE結(jié)構(gòu)域 HuR蛋白
【學(xué)位授予單位】：山東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.651
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 綜述10-17
• 1 豬瘟及豬瘟病毒概述10-11
• 1.1 豬瘟10
• 1.2 豬瘟病毒10-11
• 2 豬瘟病毒非編碼區(qū)的結(jié)構(gòu)功能11-14
• 2.1 5’UTR12-13
• 2.2 3’UTR13-14
• 3 RNA結(jié)合蛋白HuR與ARE結(jié)構(gòu)域的關(guān)系14-17
• 3.1 RNA結(jié)合蛋白HuR14-15
• 3.2 ARE結(jié)構(gòu)域15
• 3.3 RNA結(jié)合蛋白HuR與ARE的關(guān)系15-17
• 第一部分 豬瘟病毒石門株和C株非編碼區(qū)功能比對17-40
• 1 材料17-20
• 1.1 載體、菌株和細(xì)胞17
• 1.2 主要試劑17-18
• 1.3 溶液配制18-20
• 1.4 主要儀器設(shè)備20
• 2 方法20-34
• 2.1 引物設(shè)計(jì)及合成20-21
• 2.2 重組質(zhì)粒pMIR-SM3、pMIR-SM5的構(gòu)建21-29
• 2.3 重組質(zhì)粒PMIR-C3、PMIR-C5的構(gòu)建29-32
• 2.4 豬腎細(xì)胞PK-15的復(fù)蘇和培養(yǎng)32-33
• 2.5 PK-15細(xì)胞轉(zhuǎn)染33-34
• 2.6 雙熒光素酶活性檢測34
• 3 結(jié)果34-38
• 3.1 重組質(zhì)粒PMIR-SM3、PMIR-SM5鑒定34-36
• 3.2 重組質(zhì)粒pMIR-C3、pMIR-C5鑒定36-38
• 3.3 豬瘟病毒Shimen株和C株非編碼區(qū)功能比較38
• 4 討論38-40
• 第二部分 豬瘟病毒石門株 3' UTR對蛋白翻譯的調(diào)控40-66
• 1 材料40
• 2 方法40-51
• 2.1 引物設(shè)計(jì)及合成40-41
• 2.2 質(zhì)粒構(gòu)建41-50
• 2.3 PK-15細(xì)胞的復(fù)蘇和培養(yǎng)50-51
• 2.4 PK-15細(xì)胞轉(zhuǎn)染51
• 2.5 雙熒光素酶活性檢測51
• 3 結(jié)果51-64
• 3.1 1-111區(qū)在 3’UTR中起關(guān)鍵作用51-53
• 3.2 30-111區(qū)在 3’UTR中起關(guān)鍵作用53-55
• 3.3 54-106區(qū)在 3’UTR中起關(guān)鍵作用55-56
• 3.4 ARE區(qū)顯著影響熒光素酶表達(dá)56-58
• 3.5 ARE缺失降低 3’UTR對翻譯的抑制功能58-60
• 3.6 ARE能與let7協(xié)同作用60-64
• 4 討論64-66
• 第三部分 HuR對豬瘟病毒 3' UTR的調(diào)節(jié)66-79
• 1 材料66-68
• 1.1 載體、菌株和細(xì)胞66
• 1.2 主要試劑66
• 1.3 溶液配制66-68
• 2 方法68-73
• 2.1 引物設(shè)計(jì)及合成68
• 2.2 RNA的提取68-69
• 2.3 RT-PCR69
• 2.4 真核表達(dá)載體pCMV-HA-HuR的構(gòu)建69
• 2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染69
• 2.6 Western bloting69-71
• 2.7 HuR siRNA的設(shè)計(jì)及合成71-72
• 2.8 Real time RT-PCR72-73
• 2.9 雙熒光素酶活性檢測73
• 3 結(jié)果73-77
• 3.1 HuR過表達(dá)降低 3’UTR的翻譯抑制作用73-75
• 3.2 HuR干涉增強(qiáng) 3’UTR的翻譯抑制作用75-77
• 4 討論77-79
• 結(jié)論79-80
• 附錄80-84
• 參考文獻(xiàn)84-89
• 致謝89

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本文編號(hào)：703357