本文關(guān)鍵詞：精氨酸調(diào)控酪蛋白表達(dá)途徑相關(guān)miRNAs的篩選與表達(dá)分析

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【摘要】：功能性氨基酸——精氨酸(Arg)對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白的合成有一定的促進(jìn)作用,本課題組前期研究了精氨酸調(diào)控乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白合成途徑中的相關(guān)因子和其功能基因,在此基礎(chǔ)上,本研究將進(jìn)一步探索精氨酸影響奶牛乳腺酪蛋白表達(dá)的miRNA分子機(jī)制。研究包括以下四個(gè)方面部分。試驗(yàn)一精氨酸途徑調(diào)控酪蛋白表達(dá)miRNA的預(yù)測(cè)該試驗(yàn)通過PicTar和TargetScan兩種可以預(yù)測(cè)靶定目標(biāo)基因的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行預(yù)測(cè)篩選,對(duì)精氨酸調(diào)控酪蛋白合成通徑相關(guān)功能基因的表達(dá)起調(diào)控作用的miRNA入手,通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)對(duì)精氨酸調(diào)控酪蛋白合成通徑相關(guān)功能基因起調(diào)作用的miRNAs。結(jié)果顯示：通過將兩種數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì),篩選出精氨酸調(diào)控酪蛋白合成通徑中mmu-miR-325、mmu-miR-3062、mmu-miR-471-3等53個(gè)候選miRNAs可能對(duì)酪蛋白的合成具有調(diào)控作用。試驗(yàn)二體外法檢測(cè)精氨酸途徑調(diào)控酪蛋白合成的重要miRNAs本試驗(yàn)采用本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)備的二代奶牛乳腺上皮細(xì)胞,添加精氨酸進(jìn)行體外培養(yǎng),根據(jù)添加的精氨酸的量分為0倍組、1倍組、2倍組,采用RT-PCR方法檢測(cè)所篩選出精氨酸調(diào)控酪蛋白合成途徑相關(guān)的候選miRNAs的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：所篩選出的候選miRNAs中有9條：mmu-miR-743a、mmu-miR-543、mmu-miR-101a、mmu-miR-760-3p、 mmu-miR-1954、mmu-miR-712、mmu-miR-574-5p、mmu-miR-468及mmu-miR-875-3p在精氨酸組和對(duì)照組間差異顯著。提示這9條候選的miRNAs可能對(duì)精氨酸調(diào)控酪蛋白合成途徑中相關(guān)功能基因的表達(dá)起調(diào)控作用進(jìn)而影響乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白的合成。試驗(yàn)三精氨酸灌注對(duì)奶牛乳腺酪蛋白合成和miRNAs表達(dá)的影響本試驗(yàn)選擇6頭體重、胎次(4胎)、泌乳期(80±2d)、泌乳量(21.0±1.0 kg)體況(3.0)等基本一致的荷斯坦奶牛作為試驗(yàn)動(dòng)物,分3組,分別為：對(duì)照組、精氨酸組、丙氨酸組,每組2頭試驗(yàn)牛,采用3×3復(fù)拉丁方試驗(yàn)設(shè)計(jì),進(jìn)行頸靜脈灌注。結(jié)果顯示：灌注精氨酸組牛奶中乳蛋白含量和乳品質(zhì)均有提高；酪蛋白的合成量有所提高,CSN1S1、CSN1S2的表達(dá)量顯著提高；另外,體外法檢測(cè)出的差異miRNAs中mmu-miR-743a、mmu-miR-543、mmu-miR-760-3p、mmu-miR-1954、mmu-miR-712、 mmu-miR-574-5p都在精氨酸組較高(P0.05)；但miR-468在精氨酸組較低(P0.05)。提示精氨酸可能通過影響酪蛋白合成途徑這8條候選miRNAs表達(dá)的機(jī)制來影響酪蛋白合成通路相關(guān)基因的表達(dá)而最終調(diào)控酪蛋白的合成。試驗(yàn)四頸靜脈灌注精氨酸對(duì)泌乳中期奶牛氮代謝及免疫性能的影響本試驗(yàn)主要研究頸靜脈灌注精氨酸對(duì)奶牛養(yǎng)分消化、氮代謝和免疫性能的影響。試驗(yàn)設(shè)計(jì)同試驗(yàn)三。結(jié)果表明,乳蛋白氮產(chǎn)量在3組之間的差異顯著(P0.05),以精氨酸組最高,丙氨酸組次之,對(duì)照組最低。乳蛋白氮占攝入氮比例也以精氨酸組最高,但組間差異不顯著(P0.05)。代謝氮占攝入氮比例為精氨酸組對(duì)照組丙氨酸組。精氨酸組顯著提高了血清中免疫球蛋白IgG濃度、血漿中總蛋白的濃度及白蛋白與球蛋白比例(P0.05)；而谷丙轉(zhuǎn)氨酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶等指標(biāo)不受灌注的影響；同時(shí),該組血清中IL-1、TNF-a水平也較高(P0.05)�？偨Y(jié)而言：頸靜脈灌注精氨酸可通提高奶牛對(duì)氮的消化與利用來提高其乳蛋白的合成量；同時(shí)提高了奶牛血液中總蛋白、免疫球蛋白IgG及細(xì)胞因子IL-1等的水平,有利于提高奶牛機(jī)體的免疫能力和胎兒被動(dòng)的免疫力。
【關(guān)鍵詞】：精氨酸灌注 奶牛 調(diào)控 酪蛋白合成 miRNA
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S823
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 符號(hào)說明11-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-26
• 1.1 精氨酸營(yíng)養(yǎng)研究進(jìn)展13
• 1.2 精氨酸的理化性質(zhì)13-14
• 1.3 精氨酸的吸收與合成代謝14-16
• 1.3.1 精氨酸的合成14-15
• 1.3.2 精氨酸的分解代謝15-16
• 1.4 精氨酸在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用16-18
• 1.4.1 精氨酸對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能的影響16-17
• 1.4.2 精氨酸對(duì)動(dòng)物屠宰性能的影響17
• 1.4.3 精氨酸對(duì)動(dòng)物繁殖性能的影響17-18
• 1.4.4 精氨酸對(duì)動(dòng)物機(jī)體免疫功能的影響18
• 1.5 奶牛乳蛋白的合成及調(diào)控通路18-22
• 1.5.1 乳蛋白的組成18-19
• 1.5.2 乳蛋白的合成19
• 1.5.3 調(diào)控乳蛋白合成的信號(hào)通路19-22
• 1.6 精氨酸與乳蛋白合成22-23
• 1.7 miRNA對(duì)泌乳生理的調(diào)控23-25
• 1.7.1 miRNA的發(fā)生及作用機(jī)制23-24
• 1.7.2 miRNA對(duì)泌乳生理的調(diào)控24-25
• 1.8 本課題立題依據(jù)與意義25-26
• 第二章 精氨酸途徑調(diào)控酪蛋白表達(dá)miRNA的預(yù)測(cè)26-30
• 2.1 材料與方法26-28
• 2.1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)及結(jié)果獲取27-28
• 2.2 結(jié)果與分析28-29
• 2.3 討論29
• 2.4 小結(jié)29-30
• 第三章 體外法檢測(cè)精氨酸途徑調(diào)控酪蛋白合成的重要的miRNAs30-41
• 3.1 材料與方法30-33
• 3.1.1 復(fù)蘇第2代奶牛乳腺上皮細(xì)胞30
• 3.1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法30-33
• 3.1.3 統(tǒng)計(jì)與分析33
• 3.2 結(jié)果與分析33-38
• 3.2.1 酪蛋白基因表達(dá)鑒定結(jié)果33
• 3.2.2 miRNA的RT-qPCR結(jié)果分析33-34
• 3.2.3 穩(wěn)定表達(dá)的miRNA在各處理中表達(dá)34-37
• 3.2.4 目標(biāo)miRNA在各處理中相對(duì)表達(dá)結(jié)果37-38
• 3.3 討論38-40
• 3.4 小結(jié)40-41
• 第四章 精氨酸灌注對(duì)奶牛乳腺酪蛋白合成和miRNAs表達(dá)的影響41-61
• 4.1 材料與方法41-48
• 4.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物41-42
• 4.1.2 儀器設(shè)備42-43
• 4.1.3 主要試劑和材料43
• 4.1.4 試驗(yàn)方法43-48
• 4.2 結(jié)果與分析48-56
• 4.2.1 精氨酸灌注對(duì)乳品質(zhì)動(dòng)態(tài)變化的影響48-50
• 4.2.2 精氨酸灌注對(duì)酪蛋白含量動(dòng)態(tài)變化的影響50-52
• 4.2.3 總RNA的純度與完整性52-53
• 4.2.4 目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增曲線和熔解曲線53-54
• 4.2.5 精氨酸灌注對(duì)酪蛋白基因表達(dá)的影響54
• 4.2.6 精氨酸灌注對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)的影響54-55
• 4.2.7 精氨酸灌注對(duì)酪蛋白合成途徑miRNA表達(dá)的影響55-56
• 4.3 討論56-59
• 4.3.1 精氨酸灌注對(duì)牛奶蛋白合成的影響56-57
• 4.3.2 精氨酸灌注對(duì)牛奶酪蛋白含量的影響57-58
• 4.3.3 精氨酸調(diào)控酪蛋白基因表達(dá)的miRNA機(jī)制58-59
• 4.4 小結(jié)59-61
• 第五章 頸靜脈灌注精氨酸對(duì)泌乳中期奶牛氮代謝及免疫性能的影響61-69
• 5.1 材料與方法61-63
• 5.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)設(shè)計(jì)61
• 5.1.2 儀器設(shè)備61
• 5.1.3 樣品的采集61-62
• 5.1.4 試驗(yàn)方法62-63
• 5.1.5 統(tǒng)計(jì)分析63
• 5.2 結(jié)果與分析63-66
• 5.2.1 養(yǎng)分表觀消化率63-64
• 5.2.2 氮平衡64-65
• 5.2.3 對(duì)泌乳奶牛血清中免疫球蛋白的影響65-66
• 5.2.4 對(duì)泌乳奶牛血液生化指標(biāo)的影響66
• 5.2.5 對(duì)泌乳奶牛血清中IL-1,IL-6及TNF-α水平的影響66
• 5.3 討論66-68
• 5.3.1 精氨酸灌注對(duì)奶牛氮代謝的影響66-68
• 5.3.2 將氨酸灌注對(duì)奶牛免疫性能的影響68
• 5.4 小結(jié)68-69
• 第六章 全文結(jié)論69-71
• 6.1 全文結(jié)論69-70
• 6.2 創(chuàng)新點(diǎn)70
• 6.3 進(jìn)一步要研究的問題70-71
• 參考文獻(xiàn)71-83
• 致謝83-84
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文84-85

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