發(fā)布時間：2017-08-19 09:24

  本文關(guān)鍵詞：豬瘟病毒強弱毒株NS5A蛋白對病毒復制效率影響的差異分析

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【摘要】：豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一種接觸性、急性烈性傳染病。豬瘟對我國的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失,所以它已被我國列為要消滅的重大動物疫病之一。國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012—2020年)也將其列為優(yōu)先防治的一類動物疫病。目前,對于豬瘟的預(yù)防和控制,主要依靠疫苗接種和捕殺。豬瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)是預(yù)防豬瘟的最有效的疫苗。該疫苗株引起家兔產(chǎn)生定型熱反應(yīng),并且能在家兔的脾臟和淋巴結(jié)內(nèi)復制。CSFV NS5A蛋白作為該病毒RNA復制酶復合物的成分之一,主要參與病毒基因組的復制。除此之外,NS5A蛋白還能夠通過與宿主相互作用等方式,調(diào)節(jié)病毒基因組復制。本實驗室在探究CSFV NS5A蛋白與宿主的翻譯延伸因子1A(translation elongation factor 1A,eEF1A)相互作用的過程中,經(jīng)Western blotting檢測,我們發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒強弱毒株分子量存在差異。由于眾多研究表明,NS5A蛋白主要參與病毒基因組的復制。那么,強弱毒株中NS5A蛋白分子量的不同是否對CSFV的強弱毒株產(chǎn)生不同的復制效率呢?為此,我們對NS5A蛋白在CSFV強弱毒株中的復制作用展開了深入的研究。首先,我們構(gòu)建了表達海腎熒光素酶基因的嵌合報告病毒(r SM-Rluc-HCLVNS5A)以便于我們可以快速、高通量的對病毒復制情況進行定量。通過對報告病毒表達的熒光素酶進行活性分析,我們確定了NS5A蛋白對豬瘟病毒復制水平產(chǎn)生的影響。隨后,我們構(gòu)建了強弱毒株NS5A蛋白互換的嵌合病毒,通過對病毒滴度的測定和熒光定量PCR比較NS5A在強弱毒株上引起復制水平的差異。我們發(fā)現(xiàn),與原有的報告病毒(r SM-Rluc)相比,嵌合報告病毒的Rluc活性下降;以強毒株為骨架,將弱毒株NS5A替換到強毒株后,嵌合病毒(r SM-HCLVNS5A)的基因拷貝數(shù)下降,病毒滴度下降大約30倍;以弱毒株為骨架,將強毒株NS5A替換后,嵌合病毒(r HCLV-SMNS5A)基因拷貝數(shù)提高,病毒滴度上升約5倍。最后我們在家兔體內(nèi)了評價了r SM-HCLVNS5A和r HCLV-SMNS5A的定型熱反應(yīng)、復制和免疫原性,發(fā)現(xiàn)r HCLV-SMNS5A保持了HCLV株適應(yīng)家兔的特性,沒有影響HCLV株在家兔體內(nèi)的復制效率,而r SM-HCLVNS5A與石門株相同,并沒有引起家兔產(chǎn)生定型熱反應(yīng),也不在家兔脾臟內(nèi)復制。總之,本研究首次發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒強弱毒株的NS5A的蛋白分子量是不同的,并且進一步證實NS5A能夠引起豬瘟病毒強弱毒株的復制差異;體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)NS5A的替換并沒有改變HCLV株適應(yīng)家兔的特性,同時也沒有影響HCLV株在家兔體內(nèi)的復制水平。本研究為探究強弱毒株之間的復制效率差異提供思路。
【關(guān)鍵詞】：豬瘟病毒 NS5A蛋白 強弱毒株 復制差異
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 第一章 引言11-19
• 1.1 豬瘟及豬瘟病毒11-12
• 1.1.1 豬瘟11
• 1.1.2 豬瘟病毒11-12
• 1.2 非編碼區(qū)、結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的研究進展12-17
• 1.2.1 非編碼區(qū)的研究進展12
• 1.2.2 結(jié)構(gòu)蛋白的研究進展12-14
• 1.2.3 非結(jié)構(gòu)蛋白的研究進展14-17
• 1.3 豬瘟病毒反向遺傳學的研究進展17
• 1.4 研究的目的和意義17-19
• 第二章 豬瘟病毒強弱毒株NS5A蛋白對病毒復制效率的影響19-36
• 2.1 材料和方法19-25
• 2.1.1 病毒、細胞、菌種和質(zhì)粒19
• 2.1.2 主要儀器設(shè)備、抗體和試劑19
• 2.1.3 基因擴增與克隆19-20
• 2.1.4 全長感染性克隆的構(gòu)建20-22
• 2.1.5 嵌合病毒的拯救22
• 2.1.6 嵌合病毒抗原捕獲ELISA的檢測22-23
• 2.1.7 嵌合病毒的RT-PCR檢測和測序驗證23
• 2.1.8 間接免疫熒光試驗（IFA）23
• 2.1.9 病毒滴定23-24
• 2.1.10 嵌合病毒熒光定量PCR24
• 2.1.11 嵌合病毒生長曲線的測定24
• 2.1.12 海腎熒光素酶分析24
• 2.1.13 家兔接種試驗24-25
• 2.1.14 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）25
• 2.1.15 統(tǒng)計學分析25
• 2.2 結(jié)果25-33
• 2.2.1 強弱毒株NS5A蛋白分子量不同25-26
• 2.2.2 全長感染性克隆的酶切鑒定結(jié)果26-27
• 2.2.3 嵌合病毒的鑒定結(jié)果27-29
• 2.2.4 弱毒株NS5A蛋白降低CSFV強毒株的復制效率29-31
• 2.2.5 強毒株NS5A蛋白增強CSFV弱毒株的復制效率31-32
• 2.2.6 NS5A不影響HCLV株適應(yīng)家兔的特性32-33
• 2.3 討論33-36
• 第三章 全文結(jié)論36-37
• 參考文獻37-47
• 致謝47-48
• 作者簡歷48

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 HUANG Jun-hua;LI Yong-feng;HE Fan;LI Dan;SUN Yuan;HAN Wen;QIU Hua-ji;;Rapid Recovery of Classical Swine Fever Virus Directly from Cloned cDNA[J];Journal of Integrative Agriculture;2013年05期

2 鄒興啟;趙啟祖;范運峰;朱元源;王琴;徐璐;范學政;寧宜寶;;豬瘟病毒C株全長cDNA感染性克隆的構(gòu)建及病毒拯救[J];中國農(nóng)業(yè)科學;2011年02期

3 彭伍平;夏照和;侯強;李娜;孫元;童光志;仇華吉;;豬瘟病毒石門強毒株和兔化弱毒疫苗株E2蛋白糖基化位點差異分析[J];病毒學報;2007年05期

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本文編號：699926