本文關(guān)鍵詞：巴貝斯蟲(chóng)中兩種硫氧還蛋白（TrX）的克隆和功能鑒定

  更多相關(guān)文章： 田鼠巴貝斯蟲(chóng) 硫氧還蛋白 硫氧還蛋白系統(tǒng) 結(jié)構(gòu) 功能

【摘要】：田鼠巴貝斯蟲(chóng)屬于頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng),是一種胞內(nèi)寄生蟲(chóng),其缺乏過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶,主要通過(guò)硫氧還蛋白系統(tǒng)來(lái)抵抗宿主免疫細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧族分子(reactive oxygen species,ROS)和活性氮族分子(reactive nitrogen species,RNS。目前巴貝斯蟲(chóng)的Trx的功能尚不清楚,本研究從巴貝斯蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組中篩選出兩種硫氧還蛋白分子,Trx5和Trx6,克隆得到其全長(zhǎng)基因。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)快速擴(kuò)增方法分別得到基因Trx5和Trx6的全長(zhǎng)序列。Trx5全長(zhǎng)770bp,含有一個(gè)編碼201個(gè)aa的開(kāi)放閱讀框,蛋白大小約23KD,無(wú)信號(hào)肽,具有一個(gè)典型的Trx結(jié)構(gòu)域。Trx6全長(zhǎng)660bp,含有一個(gè)編碼142aa的開(kāi)放閱讀框,蛋白大小約17KD,沒(méi)有信號(hào)肽,具有一個(gè)硫氧還蛋白樣結(jié)構(gòu)域和一個(gè)有絲分裂DIM1結(jié)構(gòu)域。Western Blotting和IFAT研究表明,BmTrx5和BmTrx天然蛋白均存在于蟲(chóng)體中。通過(guò)胰島素還原法檢測(cè)Trx5和Trx6的活性,其原理為:Trx在TrxR、NADPH的作用下可以從氧化型轉(zhuǎn)變?yōu)檫�原型,還原型Trx(Trx-(SH)2)含有巰基,作用胰島素,自身又變?yōu)檠趸?氧化型Trx(Trx-S2)含有二硫鍵,在TrxR、NADPH的作用下變成還原型,這個(gè)過(guò)程需要消耗NADPH,使NADPH轉(zhuǎn)變成NADP+,還原型Trx繼續(xù)與胰島素作用,重復(fù)此過(guò)程。隨著NADPH的消耗,反應(yīng)體系在340nm處的吸光值(OD值)會(huì)降低,兩個(gè)分子的His重組蛋白均表現(xiàn)出氧化還原活性。此研究為抗巴貝斯蟲(chóng)藥物和疫苗的開(kāi)發(fā)提供了信息和理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：田鼠巴貝斯蟲(chóng) 硫氧還蛋白 硫氧還蛋白系統(tǒng) 結(jié)構(gòu) 功能
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.7
【目錄】：

• 中文摘要8-9
• Abstract9-10
• 1 前言10-17
• 1.1 原蟲(chóng)Trx的結(jié)構(gòu)10-11
• 1.2 Trx的生物學(xué)活性11-14
• 1.2.1 抗氧化作用11-12
• 1.2.2 抑制凋亡的作用12
• 1.2.3 蛋白結(jié)合作用12-13
• 1.2.4 還原并修復(fù)蛋白損傷13
• 1.2.5 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用13-14
• 1.3 Trx與癌癥14-15
• 1.4 小結(jié)15-17
• 2 材料與方法17-43
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料17
• 2.2 主要儀器17-18
• 2.3 實(shí)驗(yàn)試劑18-24
• 2.3.1 主要試劑18
• 2.3.2 試劑配方18-24
• 2.4 B.mTrx5 和Trx6的基因克隆24-28
• 2.4.1 收集田鼠巴貝斯蟲(chóng)蟲(chóng)體24-25
• 2.4.2 田鼠巴貝斯蟲(chóng)總RNA的提取25
• 2.4.3 田鼠巴貝斯蟲(chóng)cDNA的合成25-26
• 2.4.4 田鼠巴貝斯蟲(chóng)Trx5和Trx6保守片段的擴(kuò)增26-28
• 2.5 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建28-31
• 2.5.1 pET-30a空質(zhì)粒的提取28-29
• 2.5.2 pET-30a空質(zhì)粒的雙酶切29
• 2.5.3 連接及轉(zhuǎn)化29-30
• 2.5.4 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化30
• 2.5.5 陽(yáng)性菌株鑒定及測(cè)序30-31
• 2.6 巴貝斯蟲(chóng)Trx5和Trx6的 3’端快速擴(kuò)增31-34
• 2.6.1 引物設(shè)計(jì)31
• 2.6.2 cDNA第一條鏈的合成31-32
• 2.6.3 3’端的快速擴(kuò)增32-33
• 2.6.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鏈接與轉(zhuǎn)化33
• 2.6.5 3’端快速擴(kuò)增片段的克隆測(cè)序33-34
• 2.7 巴貝斯蟲(chóng)Trx5和Trx65’端快速擴(kuò)增34-37
• 2.7.1 引物設(shè)計(jì)34
• 2.7.2 cDNA第一條鏈的合成34-35
• 2.7.3 cDNA第一鏈的純化35
• 2.7.4 cDNA末端加尾35-36
• 2.7.5 目的基因 5’端的快速擴(kuò)增36-37
• 2.7.6 5’端擴(kuò)增片段的克隆測(cè)序37
• 2.8 全長(zhǎng)基因的序列分析37
• 2.9 重組蛋白的表達(dá)37-39
• 2.9.1 IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)37-38
• 2.9.2 SDS-PAGE鑒定重組蛋白38-39
• 2.10 蛋白純化及定量39-40
• 2.10.1 蛋白純化39-40
• 2.10.2 蛋白定量40
• 2.11 重組蛋白Trx5和Trx6的活性分析40-41
• 2.12 多克隆抗體的制備41
• 2.13 重組蛋白Trx5和Trx6多克隆抗體的Western blot鑒定41-42
• 2.14 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)（IFAT）42-43
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析43-59
• 3.1 總RNA的提取43
• 3.2 保守片段的擴(kuò)增43-45
• 3.2.1 Trx5的保守片段的擴(kuò)增43-44
• 3.2.2 Trx6的保守片段的擴(kuò)增44-45
• 3.3 3’race擴(kuò)增結(jié)果45-47
• 3.3.1 Trx5的 3’端快速擴(kuò)增45-46
• 3.3.2 Trx6的 3’端快速擴(kuò)增46-47
• 3.4 5’race擴(kuò)增結(jié)果47-49
• 3.4.1 Trx5的 5’端快速擴(kuò)增47-48
• 3.4.2 Trx6的 5’端快速擴(kuò)增48-49
• 3.5 基因的全長(zhǎng)及序列分析49-53
• 3.5.1 Trx5基因的全長(zhǎng)序列及預(yù)測(cè)的氨基酸序列49-51
• 3.5.2 Trx6基因的全長(zhǎng)序列及預(yù)測(cè)的氨基酸序列51-53
• 3.6 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建53
• 3.6.1 載體p ET-30a的雙酶切53
• 3.6.2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定53
• 3.7 重組蛋白的表達(dá)53-54
• 3.8 蛋白純化與定量54-55
• 3.8.1 蛋白純化54-55
• 3.8.2 蛋白定量55
• 3.9 重組蛋白的活性分析55-56
• 3.10 重組蛋白Trx5和Trx6的多克隆血清的Western blot鑒定56-57
• 3.11 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)（IFAT）檢測(cè)57-59
• 4 討論59-61
• 5 結(jié)論61-62
• 參考文獻(xiàn)62-66
• 致謝66

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