本文關(guān)鍵詞：巴貝斯蟲中兩種硫氧還蛋白（TrX）的克隆和功能鑒定

  更多相關(guān)文章： 田鼠巴貝斯蟲 硫氧還蛋白 硫氧還蛋白系統(tǒng) 結(jié)構(gòu) 功能

【摘要】：田鼠巴貝斯蟲屬于頂復(fù)門原蟲,是一種胞內(nèi)寄生蟲,其缺乏過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶,主要通過硫氧還蛋白系統(tǒng)來抵抗宿主免疫細胞產(chǎn)生的活性氧族分子(reactive oxygen species,ROS)和活性氮族分子(reactive nitrogen species,RNS。目前巴貝斯蟲的Trx的功能尚不清楚,本研究從巴貝斯蟲轉(zhuǎn)錄組中篩選出兩種硫氧還蛋白分子,Trx5和Trx6,克隆得到其全長基因。本實驗通過快速擴增方法分別得到基因Trx5和Trx6的全長序列。Trx5全長770bp,含有一個編碼201個aa的開放閱讀框,蛋白大小約23KD,無信號肽,具有一個典型的Trx結(jié)構(gòu)域。Trx6全長660bp,含有一個編碼142aa的開放閱讀框,蛋白大小約17KD,沒有信號肽,具有一個硫氧還蛋白樣結(jié)構(gòu)域和一個有絲分裂DIM1結(jié)構(gòu)域。Western Blotting和IFAT研究表明,BmTrx5和BmTrx天然蛋白均存在于蟲體中。通過胰島素還原法檢測Trx5和Trx6的活性,其原理為:Trx在TrxR、NADPH的作用下可以從氧化型轉(zhuǎn)變?yōu)檫�原型,還原型Trx(Trx-(SH)2)含有巰基,作用胰島素,自身又變?yōu)檠趸?氧化型Trx(Trx-S2)含有二硫鍵,在TrxR、NADPH的作用下變成還原型,這個過程需要消耗NADPH,使NADPH轉(zhuǎn)變成NADP+,還原型Trx繼續(xù)與胰島素作用,重復(fù)此過程。隨著NADPH的消耗,反應(yīng)體系在340nm處的吸光值(OD值)會降低,兩個分子的His重組蛋白均表現(xiàn)出氧化還原活性。此研究為抗巴貝斯蟲藥物和疫苗的開發(fā)提供了信息和理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：田鼠巴貝斯蟲 硫氧還蛋白 硫氧還蛋白系統(tǒng) 結(jié)構(gòu) 功能
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.7
【目錄】：

• 中文摘要8-9
• Abstract9-10
• 1 前言10-17
• 1.1 原蟲Trx的結(jié)構(gòu)10-11
• 1.2 Trx的生物學(xué)活性11-14
• 1.2.1 抗氧化作用11-12
• 1.2.2 抑制凋亡的作用12
• 1.2.3 蛋白結(jié)合作用12-13
• 1.2.4 還原并修復(fù)蛋白損傷13
• 1.2.5 生長調(diào)節(jié)作用13-14
• 1.3 Trx與癌癥14-15
• 1.4 小結(jié)15-17
• 2 材料與方法17-43
• 2.1 實驗材料17
• 2.2 主要儀器17-18
• 2.3 實驗試劑18-24
• 2.3.1 主要試劑18
• 2.3.2 試劑配方18-24
• 2.4 B.mTrx5 和Trx6的基因克隆24-28
• 2.4.1 收集田鼠巴貝斯蟲蟲體24-25
• 2.4.2 田鼠巴貝斯蟲總RNA的提取25
• 2.4.3 田鼠巴貝斯蟲cDNA的合成25-26
• 2.4.4 田鼠巴貝斯蟲Trx5和Trx6保守片段的擴增26-28
• 2.5 表達質(zhì)粒的構(gòu)建28-31
• 2.5.1 pET-30a空質(zhì)粒的提取28-29
• 2.5.2 pET-30a空質(zhì)粒的雙酶切29
• 2.5.3 連接及轉(zhuǎn)化29-30
• 2.5.4 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化30
• 2.5.5 陽性菌株鑒定及測序30-31
• 2.6 巴貝斯蟲Trx5和Trx6的 3’端快速擴增31-34
• 2.6.1 引物設(shè)計31
• 2.6.2 cDNA第一條鏈的合成31-32
• 2.6.3 3’端的快速擴增32-33
• 2.6.4 PCR擴增產(chǎn)物的鏈接與轉(zhuǎn)化33
• 2.6.5 3’端快速擴增片段的克隆測序33-34
• 2.7 巴貝斯蟲Trx5和Trx65’端快速擴增34-37
• 2.7.1 引物設(shè)計34
• 2.7.2 cDNA第一條鏈的合成34-35
• 2.7.3 cDNA第一鏈的純化35
• 2.7.4 cDNA末端加尾35-36
• 2.7.5 目的基因 5’端的快速擴增36-37
• 2.7.6 5’端擴增片段的克隆測序37
• 2.8 全長基因的序列分析37
• 2.9 重組蛋白的表達37-39
• 2.9.1 IPTG誘導(dǎo)蛋白表達37-38
• 2.9.2 SDS-PAGE鑒定重組蛋白38-39
• 2.10 蛋白純化及定量39-40
• 2.10.1 蛋白純化39-40
• 2.10.2 蛋白定量40
• 2.11 重組蛋白Trx5和Trx6的活性分析40-41
• 2.12 多克隆抗體的制備41
• 2.13 重組蛋白Trx5和Trx6多克隆抗體的Western blot鑒定41-42
• 2.14 間接免疫熒光實驗（IFAT）42-43
• 3 實驗結(jié)果及分析43-59
• 3.1 總RNA的提取43
• 3.2 保守片段的擴增43-45
• 3.2.1 Trx5的保守片段的擴增43-44
• 3.2.2 Trx6的保守片段的擴增44-45
• 3.3 3’race擴增結(jié)果45-47
• 3.3.1 Trx5的 3’端快速擴增45-46
• 3.3.2 Trx6的 3’端快速擴增46-47
• 3.4 5’race擴增結(jié)果47-49
• 3.4.1 Trx5的 5’端快速擴增47-48
• 3.4.2 Trx6的 5’端快速擴增48-49
• 3.5 基因的全長及序列分析49-53
• 3.5.1 Trx5基因的全長序列及預(yù)測的氨基酸序列49-51
• 3.5.2 Trx6基因的全長序列及預(yù)測的氨基酸序列51-53
• 3.6 表達質(zhì)粒的構(gòu)建53
• 3.6.1 載體p ET-30a的雙酶切53
• 3.6.2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定53
• 3.7 重組蛋白的表達53-54
• 3.8 蛋白純化與定量54-55
• 3.8.1 蛋白純化54-55
• 3.8.2 蛋白定量55
• 3.9 重組蛋白的活性分析55-56
• 3.10 重組蛋白Trx5和Trx6的多克隆血清的Western blot鑒定56-57
• 3.11 間接免疫熒光實驗（IFAT）檢測57-59
• 4 討論59-61
• 5 結(jié)論61-62
• 參考文獻62-66
• 致謝66

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

1 衛(wèi)麗;黃曉書;李鵬坤;張慧琴;王同朝;;植物硫氧還蛋白研究進展[J];貴州農(nóng)業(yè)科學(xué);2006年06期

2 戴和平;;藍藻的硫氧還蛋白[J];水生生物學(xué)報;1992年04期

3 蘇榮勝;胡鍇;劉傳敦;劉好朋;萬婷;潘家強;唐兆新;;硫氧還蛋白及其與腫瘤的關(guān)系[J];中國獸醫(yī)雜志;2011年01期

4 鄭瓊;馬旭俊;楊傳平;;硫氧還蛋白(Trx)的研究進展[J];分子植物育種;2006年S2期

5 余文蘭;王朵朵;郭劍英;胡蓮美;;硫氧還蛋白對過氧化氫誘導(dǎo)的BRL-3A細胞損傷的保護作用[J];中國畜牧獸醫(yī);2014年06期

6 劉會敏;孫力軍;任海英;董漢松;;煙草硫氧還蛋白NtTRXh功能域研究[J];江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報;2010年02期

7 曹玲瓏;李冬兵;熊大斌;鄧利;牛洪斌;姜玉梅;尹鈞;;小麥h型硫氧還蛋白Trx-h酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建和自激活檢測[J];河南農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年07期

8 程雷;王蕾蕾;程備久;范軍;;玉米過氧化物還原蛋白BAS1的原核表達及其功能研究[J];中國生物工程雜志;2010年11期

9 ;[J];;年期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 劉晨臨;黃曉航;Lee Yookyung;李光友;;日本凋毛藻Griffithsia japonica的硫氧還蛋白研究[A];中國海洋生化學(xué)術(shù)會議論文薈萃集[C];2005年

2 賈凌云;甄偉;王望;王憲;;鈣網(wǎng)蛋白通過增加硫氧還蛋白減輕缺氧造成的肺泡Ⅱ型上皮細胞損傷[A];中國生理學(xué)會第五屆全國心血管、呼吸和腎臟生理學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2005年

3 沈恂;鄭翌;劉光慧;劉振波;陳北冬;;硫氧還蛋白/硫氧還蛋白還原酶對基因表達和鈣信號的調(diào)控作用[A];第六屆全國自由基生物學(xué)與自由基醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議和海峽兩岸自由基生物學(xué)與自由基醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文集[C];2004年

4 甘璐;劉瓊;徐輝碧;朱玉山;楊祥良;;過量硒補充對谷胱甘肽過氧化物酶和硫氧還蛋白還原酶基因表達和活性的影響[A];第九次全國生物物理大會學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2002年

5 戴波;肖定璋;林秋雄;鄭猛;余細勇;;類硫氧還蛋白-2基因真核表達載體構(gòu)建及其表達[A];2008第十一次全國臨床藥理學(xué)學(xué)術(shù)大會論文集[C];2008年

6 陳孝平;唐文心;胡勝;陳正望;;核內(nèi)硫氧還蛋白與乳腺癌細胞MCF-7的凋亡正相關(guān)[A];湖北省暨武漢市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會第八屆第十七次學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2007年

7 張振義;包銳;俞江;周從照;陳宇星;;釀酒酵母胞質(zhì)硫氧還蛋白還原酶(Trr1)的結(jié)構(gòu)及功能[A];中國晶體學(xué)會第四屆全國會員代表大會暨學(xué)術(shù)會議學(xué)術(shù)論文摘要集[C];2008年

8 唐文心;陳孝平;陳正望;;抗人硫氧還蛋白-1單克隆抗體的制備與鑒定[A];湖北省暨武漢市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會第八屆第十七次學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2007年

9 孫荷;譚國強;黃雪芳;丁煥根;呂建新;;硫氧還蛋白還原酶在基因敲除大腸桿菌中的克隆表達及體內(nèi)外活性測定[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會2006年學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2006年

10 高小博;馬旭;陸彩玲;;丙烯酰胺對硒蛋白谷胱甘肽過氧化物酶和硫氧還蛋白還原酶活性的影響[A];中國毒理學(xué)會第六屆全國毒理學(xué)大會論文摘要[C];2013年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 賈金婧;硫氧還蛋白-1抵抗環(huán)境應(yīng)答中腎上腺素損傷的分子機理[D];昆明理工大學(xué);2015年

2 唐文心;硫氧還蛋白-1的生物學(xué)功能研究[D];華中科技大學(xué);2009年

3 金擰;人的類硫氧化還原蛋白催化結(jié)構(gòu)域的三維晶體結(jié)構(gòu)及其功能的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2002年

4 段東柱;以硫氧還蛋白還原酶為靶點的天然化合物抗腫瘤機制研究[D];蘭州大學(xué);2014年

5 張翠軍;水稻質(zhì)外體h型硫氧還蛋白OsTRXh1對水稻生長發(fā)育和脅迫反應(yīng)的調(diào)節(jié)及其機制[D];河北師范大學(xué);2010年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張亞芳;水稻硫氧還蛋白OsTRXh1結(jié)合蛋白的鑒定及功能研究[D];河北師范大學(xué);2011年

2 吳恒乾;硫氧還蛋白-1抵抗甲基苯丙胺復(fù)吸的作用研究[D];昆明理工大學(xué);2016年

3 方姣龍;硫氧還蛋白-1抑制甲基苯丙胺戒斷的抑郁行為[D];昆明理工大學(xué);2016年

4 張浩;巴貝斯蟲中兩種硫氧還蛋白（TrX）的克隆和功能鑒定[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

5 王曉慧;黑曲霉硫氧還蛋白體系基因的克隆、鑒定、融合及其在食品工程中的應(yīng)用[D];浙江大學(xué);2010年

6 向玲娟;硫氧還蛋白對同種異體移植炎癥因子（AIF-1）的調(diào)控機理研究[D];武漢工程大學(xué);2014年

7 王艷琦;硫氧還蛋白-1參與雌激素在過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡中的保護作用[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2013年

8 孔令聘;硫氧還蛋白-1抵抗甲基苯丙胺所致條件性位置偏好的作用及其分子機制[D];昆明理工大學(xué);2015年

9 李奎;嗎啡影響小鼠大腦內(nèi)硫氧還蛋白表達的研究[D];昆明理工大學(xué);2009年

10 朱勤俊;基于磁共振的硫氧還蛋白還原酶結(jié)構(gòu)的表征[D];華中師范大學(xué);2014年

，

本文編號：695071