本文關(guān)鍵詞：雞堆型艾美耳球蟲Rhomboid增強型核酸疫苗構(gòu)建及免疫保護作用

  更多相關(guān)文章： 堆型艾美耳球蟲 Rhomboid 核酸疫苗 抗球蟲指數(shù) 免疫保護

【摘要】：雞球蟲病(Coccidiosis)是由艾美耳球蟲屬7種球蟲引起的腸道寄生蟲疾病,其中堆型艾美耳球蟲(Eimeria acervulina)是其主要病原之一。雞球蟲子孢子入侵到腸道上皮細胞并增殖使其嚴(yán)重受損從而導(dǎo)致飼料轉(zhuǎn)化率降低、增重降低,這給養(yǎng)禽生產(chǎn)業(yè)造成極大的損失。過去,雞球蟲病主要靠藥物防治,但是由此引發(fā)球蟲耐藥株的產(chǎn)生和藥物殘留等嚴(yán)重問題,現(xiàn)在球蟲疫苗免疫防治逐漸替代藥物防治,其中篩選有效的免疫抗原是制備高效新型球蟲疫苗的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。Rhomboid屬于廣泛分布的絲氨酸蛋白酶家族,在球蟲發(fā)育和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中執(zhí)行各種各樣功能,特別是在球蟲入侵過程中發(fā)揮著重要的作用,可能是其潛在的免疫性抗原。根據(jù)GenBank柔嫩艾美耳球蟲Rhomboid基因序列(DQ323509.1)設(shè)計特異性引物,以堆型艾美耳球蟲c DNA為模板PCR擴增包含Rhomboid基因ORF片段。抗原表位分析后設(shè)計表達區(qū)域特異性引物,PCR擴增后連接于pGEX-6p-1原核表達載體并成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-Rhomboid。將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli Rosetta中IPTG誘導(dǎo)表達,SDS-PAGE顯示有36 ku預(yù)期蛋白表達。純化后的蛋白免疫新西蘭大白兔制備兔抗Rhomboid多抗。ELISA檢測多抗效價達216,Western-blot檢測表明制備的多抗具有良好的反應(yīng)性和特異性。本試驗同時構(gòu)建pc DNA-Rhomboid及pc DNA-IFN-γ-Rhomboid重組真核表達質(zhì)粒,體外瞬時轉(zhuǎn)染表明Rhomboid及IFN-γ均可在BHK21細胞內(nèi)表達,可用作免疫動物DNA疫苗使用。試驗雛雞分為5組,分別為兩個真核質(zhì)粒免疫組即pc DNA-Rhomboid質(zhì)粒免疫組(Rho組)和pc DNA-IFN-γ-Rhomboid質(zhì)粒免疫組(IFN-γ-Rho組),兩個攻蟲對照組即PBS注射攻蟲組(PBS組)和pc DNA3.1空白質(zhì)粒注射組(pc DNA組)和不攻蟲對照組(Control組)。在14及21日齡時,除Control組每只雞分別胸部肌肉注射100μL PBS或100μg pc DNA3.1、pc DNA-Rhomboid或pc DNA-IFN-γ-Rhomboid,在28日齡時,感染組雛雞口服接種孢子化卵囊1×105個。分別在14、21、28、35及42日齡時,檢測每組雛雞淋巴細胞增殖功能、血清中抗Rhomboid IgG抗體變化及體增重變化,35日齡時,檢測各組的十二指腸病變計分、克糞便卵囊數(shù)量(OPG)值并計算抗球蟲指數(shù)(ACI)。結(jié)果表明,Rho組與IFN-γ-Rho組的淋巴細胞增殖活性及特異性IgG抗體隨著免疫次數(shù)增加顯著或極顯著高于對照組;Rho組與IFN-γ-Rho組ACI分別為166.35和172.40,起到較好的抗球蟲保護作用。綜上,Rhomboid可以作為一種抗球蟲的潛在候選基因,雞IFN-γ可以起到免疫佐劑作用。本研究為研制抗球蟲病疫苗提供了理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：堆型艾美耳球蟲 Rhomboid 核酸疫苗 抗球蟲指數(shù) 免疫保護
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.31
【目錄】：

• 摘要8-9
• 英文摘要9-11
• 1 前言11-19
• 1.1 雞球蟲概述11-14
• 1.1.1 雞球蟲及其發(fā)育史11-12
• 1.1.2 雞球蟲入侵機制研究進展12-13
• 1.1.3 Rhomboid研究進展13-14
• 1.2 雞抗球蟲免疫反應(yīng)14-16
• 1.2.1 體液免疫14-15
• 1.2.2 細胞免疫15-16
• 1.3 IFN-γ研究進展16
• 1.3.1 IFN-γ概述16
• 1.3.2 雞IFN-γ在抗球蟲病中的作用16
• 1.4 抗球蟲病DNA疫苗的研究進展16-17
• 1.5 研究的目的與意義17-19
• 2 材料與方法19-38
• 2.1 實驗材料19-22
• 2.1.1 實驗動物及蟲種19
• 2.1.2 菌株、載體及細胞19
• 2.1.3 主要試劑19
• 2.1.4 主要儀器與設(shè)備19-20
• 2.1.5 主要試劑的配制20-22
• 2.2 實驗方法22-38
• 2.2.1 堆型艾美耳球蟲Rhomboid基因的克隆與鑒定22-27
• 2.2.2 Rhomboid蛋白的原核表達及鑒定27-29
• 2.2.3 Rhomboid蛋白多克隆抗體的制備及生物學(xué)活性檢測29-31
• 2.2.4 重組真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及體外瞬時轉(zhuǎn)染31
• 2.2.5 重組真核表達質(zhì)粒的大量提取及純化31-33
• 2.2.6 試驗動物的分組和處理33-34
• 2.2.7 體外淋巴細胞增殖試驗34-35
• 2.2.8 ELISA檢測外周血中抗Rhomboid蛋白的IgG抗體水平35
• 2.2.9 免疫重組真核表達質(zhì)粒對球蟲感染的保護效果35-37
• 2.2.10 數(shù)據(jù)處理37-38
• 3 結(jié)果38-55
• 3.1 堆型艾美耳球蟲Rhomboid基因的克隆與鑒定38-39
• 3.1.1 Rhomboid基因的克隆38
• 3.1.2 重組克隆質(zhì)粒pMD18-T-Rhomboid構(gòu)建與鑒定38-39
• 3.2 Rhomboid蛋白的原核表達及鑒定39-45
• 3.2.1 原核表達質(zhì)粒pGEX-Rhomboid的構(gòu)建及鑒定39-40
• 3.2.2 Rhomboid蛋白的原核表達及純化40-41
• 3.2.3 Rhomboid蛋白多克隆抗體的制備及生物學(xué)活性檢測41-42
• 3.2.4 重組真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定42-44
• 3.2.5 重組真核表達質(zhì)粒的體外瞬時表達44-45
• 3.3 雛雞脾臟及外周血T淋巴細胞增殖功能變化45-48
• 3.3.1 脾臟T淋巴細胞增殖功能變化45-47
• 3.3.2 外周血T淋巴細胞增殖功能變化47-48
• 3.4 雛雞脾臟及外周血B淋巴細胞增殖功能變化48-50
• 3.4.1 脾臟B淋巴細胞增殖功能變化48-49
• 3.4.2 外周血B淋巴細胞增殖功能變化49-50
• 3.5 Rhomboid蛋白刺激雛雞脾臟和外周血淋巴細胞增殖功能變化50-52
• 3.5.1 Rhomboid蛋白刺激脾臟淋巴細胞增殖功能變化50-51
• 3.5.2 Rhomboid蛋白刺激外周血淋巴細胞增殖功能變化51-52
• 3.6 外周血中抗Rhomboid蛋白IgG抗體含量動態(tài)變化52-53
• 3.7 重組真核表達質(zhì)�？骨蛳x保護效果53-55
• 3.7.1 雛雞體增重情況53-54
• 3.7.2 克糞便卵囊排出數(shù)與十二指腸病變計分54
• 3.7.3 抗球蟲指數(shù)54-55
• 4 討論55-59
• 4.1 堆型艾美耳球蟲Rhomboid抗原的選擇55-56
• 4.2 重組Rhomboid蛋白的表達56
• 4.3 重組DNA疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)與保護作用56-59
• 4.3.1 雛雞免疫后T、B淋巴細胞增殖功能變化57
• 4.3.2 Rhomboid蛋白刺激后淋巴細胞增殖功能變化57
• 4.3.3 外周血中抗Rhomboid蛋白IgG抗體動態(tài)變化57-58
• 4.3.4 重組DNA疫苗的抗球蟲免疫保護效果58-59
• 5 結(jié)論59-60
• 致謝60-61
• 參考文獻61-65
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文65

，

本文編號：693329