本文關(guān)鍵詞：我國羊巴貝斯蟲分子流行病學(xué)調(diào)查及基因組物理圖譜繪制

  更多相關(guān)文章： 羊巴貝斯蟲 實時熒光定量PCR 分子流行病學(xué)調(diào)查 BAC文庫 物理圖譜

【摘要】：巴貝斯蟲是一類寄生于人和動物紅細(xì)胞內(nèi)的隸屬于巴貝斯屬(Babesia)的蜱傳性血液原蟲,。動物感染巴貝斯蟲后即患巴貝斯蟲病(Babesiosis),該病又被稱為蜱傳熱、紅尿熱等。動物感染該病后表現(xiàn)出發(fā)熱、貧血、黃疸、血紅蛋白尿等臨床癥狀,嚴(yán)重時甚至?xí)鹚劳觥Ｔ摬》植挤秶鷱V,在世界各地都有流行,給畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國羊巴貝斯蟲病研究起步較晚,對其病原種類、分布和生物學(xué)特性尚不十分清楚。本研究首先應(yīng)用Real-time PCR檢測技術(shù),對我國現(xiàn)已分離鑒定到的兩種羊的巴貝斯蟲——莫氏巴貝斯蟲(Babesia motasi)和巴貝斯蟲未定種(Babesia sp.)在十個省區(qū)開展了分子流行病學(xué)調(diào)查;然后以羊巴貝斯蟲未定種新疆株(Babesia sp.Xinjiang)為研究對象,根據(jù)已構(gòu)建的其細(xì)菌人工染色體(Bacterial Artificial Chromosome,BAC)文庫和二、三代全基因組序列測序數(shù)據(jù),繪制羊巴貝斯蟲未定種新疆株物理圖譜。對了解該病病原的在我國的分布和基因組結(jié)構(gòu)做了初步的探索研究。為了調(diào)查和分析羊的巴貝斯蟲在我國的分布情況,2010-2014年間,于我國10個省區(qū)共采集到823份綿羊和山羊血液樣本,并提取基因組DNA。應(yīng)用區(qū)分莫氏巴貝斯蟲和羊巴貝斯蟲未定種的Real-time PCR方法,對提取的基因組DNA進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示,除了海南省,其它省份都檢測到莫氏巴貝斯蟲的感染,總體陽性率為5.95%(49/823),其中河南陽性率最高,為10.47%(9/86);而羊巴貝斯蟲未定種只在湖北、貴州和甘肅省檢測到,陽性率分別為4.55%(2/44)、6.38%(3/47)和0.62%(2/322)。本研究首次應(yīng)用實時熒光定量PCR對我國羊巴貝斯蟲病的流行狀況進(jìn)行大范圍的調(diào)查,為了解我國羊巴貝斯蟲的分布情況和制定相應(yīng)的羊巴貝斯蟲病防控策略提供了數(shù)據(jù)支持。綜合羊巴貝斯蟲未定種新疆株基因組測序組裝數(shù)據(jù),根據(jù)定位和設(shè)計的204對篩庫引物,通過對羊巴貝斯蟲未定種新疆株BAC文庫約1.5萬個PCR篩選和相應(yīng)的酶切指紋圖譜驗證,初步得到覆蓋其基因組的171個BAC陽性克隆,并成功構(gòu)建了測序組裝的5條Scaffold的克隆重疊群圖譜,其總長度約8.47Mb,對其基因組的覆蓋度達(dá)到了99%左右,與此同時在構(gòu)建好的克隆重疊圖中有6對引物沒有篩選到陽性克隆,還有1對引物篩庫引物的實際擴增片段大小與目的產(chǎn)物大小有一定的差異。這意味著在已有數(shù)據(jù)的拼接結(jié)果中存有錯誤拼接。該研究為進(jìn)一步精確組裝該巴貝斯蟲的全基因組序列數(shù)據(jù),做了前期探索性的工作。
【關(guān)鍵詞】：羊巴貝斯蟲 實時熒光定量PCR 分子流行病學(xué)調(diào)查 BAC文庫 物理圖譜
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.26;S858.27
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 英文縮略表10-11
• 第一章 引言11-20
• 1.1 巴貝斯蟲的簡介11-13
• 1.1.1 巴貝斯蟲的分類11
• 1.1.2 巴貝斯蟲的病原11-12
• 1.1.3 巴貝斯蟲的生活史12
• 1.1.4 巴貝斯蟲病流行病學(xué)12-13
• 1.2 巴貝斯蟲病診斷技術(shù)13-16
• 1.2.1 病原學(xué)診斷13-14
• 1.2.2 血清學(xué)診斷14
• 1.2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）14
• 1.2.2.2 乳膠凝集試驗(LAT)14
• 1.2.3 分子生物學(xué)診斷14-16
• 1.2.3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）15
• 1.2.3.4 實時熒光定量PCR技術(shù)（Real-time PCR)15-16
• 1.3 巴貝斯蟲基因組研究16
• 1.4 人工染色體（BAC）16-17
• 1.5 基因組物理圖譜17-18
• 1.5.1 菌落雜交法17
• 1.5.2 分子標(biāo)記法17-18
• 1.5.3 酶切指紋法18
• 1.6 物理圖譜的應(yīng)用18-19
• 1.6.1 基因組測序18
• 1.6.2 基因的圖位克隆18
• 1.6.3 比較基因組學(xué)研究18-19
• 1.7 本研究的目的和意義19-20
• 第二章 我國十省區(qū)羊巴貝斯蟲流行病學(xué)調(diào)查20-24
• 2.1 材料與方法20-21
• 2.1.1 樣品20
• 2.1.2 主要試劑和儀器20-21
• 2.2 實驗方法21-22
• 2.2.1 血液基因組DNA提取21
• 2.2.2 實時熒光定量PCR21-22
• 2.3 實驗結(jié)果22
• 2.4 討論22-24
• 第三章 羊巴貝斯蟲新疆株物理圖譜繪制24-45
• 3.1 實驗試劑與儀器24
• 3.2 試驗方法24-27
• 3.2.1 巴貝斯蟲測序基因組提取24
• 3.2.2 巴貝斯蟲篩庫基因組提取24-25
• 3.2.3 引物定位與設(shè)計25
• 3.2.4 BAC板庫制粒復(fù)制25
• 3.2.5 BAC板庫、行庫和列庫制備25-26
• 3.2.6 BAC文庫篩選26
• 3.2.7 BAC質(zhì)粒提取26
• 3.2.8 BAC質(zhì)粒酶切驗證26
• 3.2.9 陽性克隆指紋酶切指紋圖譜驗證和克隆重疊群構(gòu)建26-27
• 3.2.10 核型分析與Scaffold定位27
• 3.3 結(jié)果與分析27-43
• 3.3.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計27
• 3.3.2 BAC板庫、行庫和列庫質(zhì)粒濃度處理27
• 3.3.3 引物設(shè)計與篩庫結(jié)果27-38
• 3.3.4 質(zhì)粒酶切驗證38-39
• 3.3.5 酶切指紋圖譜驗證39-42
• 3.3.6 核型分析與Scaffold定位42-43
• 3.4 討論43-45
• 第四章 全文結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-51
• 致謝51-52
• 作者簡歷52

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