發(fā)布時(shí)間：2017-08-16 02:16

  本文關(guān)鍵詞：1型鴨甲肝病毒2A蛋白功能初探

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【摘要】：鴨甲型肝炎病毒(DHAV)屬于小RNA病毒科的禽肝病毒屬,對(duì)雛鴨具有高致病性和高致死率,具有傳播迅速的特點(diǎn)。為了探究其2A蛋白的功能,我們開(kāi)展了2A蛋白生物信息學(xué)特性、2A2和2A3蛋白的原核表達(dá)純化、制備抗2A1/2A2/2A3蛋白的多克隆抗體、2A1蛋白自我切割功能、2A2和2A3蛋白的完整性和獨(dú)立性、2A2蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、2A2蛋白的GTPase活性等項(xiàng)研究。獲如下結(jié)果：1、2A蛋白的生物信息學(xué)特性分析通過(guò)NetPicoRna V1.0在線服務(wù)器預(yù)測(cè)2A蛋白的切割位點(diǎn)：2A1和2A2之間的切割位點(diǎn)是NPG/P,2A2和2A3之間的切割位點(diǎn)是S/H;運(yùn)用ClustalW軟件對(duì)DHAV-1的2A蛋白與其他小RNA病毒的2A蛋白進(jìn)行多重蛋白質(zhì)序列比對(duì),經(jīng)GeneDoc軟件進(jìn)行整理編輯,結(jié)果表明DHAV-1的2A蛋白是由NPGP樣的2A1、GTPase樣的2A2和H-NC樣的2A3組成。將2A2氨基酸序列輸入MEGA6.0,通過(guò)neighbour-joining (NJ)方法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)以及用SWISS-MODEL服務(wù)器對(duì)2A2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模,預(yù)測(cè)分析表明2A2蛋白與GTPase家族具有相同的進(jìn)化來(lái)源和結(jié)構(gòu)上的相似性。2、2A2蛋白和2A3蛋白的原核表達(dá)、純化及免疫印跡試驗(yàn)根據(jù)2A2和2A3的基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物P1P2和P3P4,從含DHAV-1的鴨胚尿囊液中提取RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA并作為模板,PCR擴(kuò)增分別獲得2A2基因和2A3基因片段,克隆至pMD19-T載體,鑒定正確后,再分別亞克隆至pET-32(a)+原核表達(dá)載體。獲得2A2蛋白和2A3蛋白的最佳表達(dá)條件均為用0.4 mmol/L IPTG于37℃誘導(dǎo)4 h；2A2蛋白可經(jīng)洗滌包涵體的方式純化,2A3蛋白通過(guò)Ni2+-NTA瓊脂糖凝膠親和層析進(jìn)行純化。表達(dá)的兩種蛋白經(jīng)免疫印跡證實(shí)能夠被鴨抗DHAV-1抗體識(shí)別。3、鼠或兔抗2A1、2A2和2A3蛋白多克隆抗體的制備人工合成的2A1蛋白多肽免疫小鼠制備鼠抗2A1蛋白的多克隆抗體,通過(guò)ELISA測(cè)得其抗體效價(jià)為1：6400；經(jīng)包涵體洗滌純化的2A2蛋白分別免疫小鼠和兔子制備鼠抗和兔抗2A2蛋白的多克隆抗體,結(jié)果鼠抗和兔抗的瓊擴(kuò)效價(jià)均為1：16;通過(guò)Ni2+-NTA瓊脂糖凝膠親和層析純化的2A3蛋白免疫兔子制備兔抗2A3蛋白的多克隆抗體,其瓊擴(kuò)效價(jià)最高為1：32。4、2A1蛋白的自我切割試驗(yàn)根據(jù)紅色熒光蛋白(RFP)的基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物P1P2,以pDsRED載體為模板,擴(kuò)增RFP片段；將2A1基因的反向互補(bǔ)序列插入到P2的5’端,即得到了擴(kuò)增RED-2A1片段的下游引物P3,利用引物P1P3,以pDsRED載體為模板,擴(kuò)增RED-2A1片段；將RFP片段和RED-2A1片段分別插入pEGFP-N1,獲得含有雙熒光報(bào)告基因的重組質(zhì)粒pRED-EGFP和pRED-2A1-EGFP;將構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF),在熒光顯微鏡下可以看到同一視野中的細(xì)胞發(fā)出紅色和綠色兩種熒光,說(shuō)明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功；分別提取轉(zhuǎn)染了pRED-EGFP、pRED-2A1-EGFP、pDsRED和pEGFP-N1四種質(zhì)粒后的細(xì)胞的總蛋白,經(jīng)SDS-PAGE后,分別用抗2A1蛋白抗體、抗紅色和綠色熒光蛋白的抗體做免疫印跡,結(jié)果表明2A1蛋白具有自我切割的功能。5、2A2和2A3蛋白完整性、獨(dú)立性試驗(yàn)DHAV-1接種DEF后72 h時(shí),收集并裂解細(xì)胞,將獲得的細(xì)胞裂解液上清分為兩份并分別與兔抗2A2和2A3蛋白抗體進(jìn)行免疫沉淀(IP)試驗(yàn),結(jié)果兩種不同的抗體沉淀出了兩種分子量不同的蛋白；用鴨抗DHAV-1抗體經(jīng)免疫印跡分析表明這兩種蛋白分別為2A2和2A3蛋白。感染DHAV-1后的DEF進(jìn)行間接免疫熒光(IFA)試驗(yàn),同一細(xì)胞同時(shí)用兩種不同的一抗(兔抗2A3蛋白抗體和鼠抗2A2蛋白抗體)進(jìn)行孵育,再用FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG和TRITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG的二抗同時(shí)進(jìn)行孵育,試驗(yàn)結(jié)果表明2A2蛋白主要定位在細(xì)胞核中,少量定位在細(xì)胞質(zhì)中,而2A3蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)中,少量定位在細(xì)胞核中。IP及IFA結(jié)果表明DHAV-1的2A2蛋白與2A3蛋白是兩個(gè)相互獨(dú)立的蛋白。6、2A2蛋白誘導(dǎo)鴨胚成纖維細(xì)胞凋亡試驗(yàn)將已構(gòu)建好的pMD19-T/2A2質(zhì)粒與pcDNA3.1(+)空載分別用BamHⅠ租Xho Ⅰ雙酶切后進(jìn)行連接,成功獲得真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/2A2,并將其轉(zhuǎn)染DEF,36 h時(shí)收獲細(xì)胞,通過(guò)IFA及免疫印跡分析表明2A2蛋白在DEF中表達(dá)。轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒48 h時(shí)收獲細(xì)胞,提取細(xì)胞的DNA,經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳可以看到明顯的DNA Ladder;通過(guò)HE染色和DAPI細(xì)胞核染色可以看到細(xì)胞核出現(xiàn)邊移、碎裂的凋亡現(xiàn)象；TUNEL法觀察到凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核染成深棕色；經(jīng)過(guò)Annexin V-FITC/PI雙染后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/2A2的實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞的比率明顯高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)的對(duì)照組。結(jié)果表明DHAV-1的2A2蛋白能夠誘導(dǎo)DEF凋亡。7、2A2蛋白的GTP酶活性試驗(yàn)誘導(dǎo)原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32(a)+/2A2表達(dá),將表達(dá)于上清中的2A2蛋白通過(guò)Ni2+-NTA瓊脂糖凝膠親和層析進(jìn)行純化,利用GTP酶試劑盒驗(yàn)證其是否具有GTPase活性。結(jié)果表明DHAV-1的2A2蛋白在室溫下30 min就能夠水解GTP產(chǎn)生游離的磷酸根,其與試劑盒中的孔雀綠試劑反應(yīng)形成深綠色的產(chǎn)物,在620 nm處測(cè)定其吸光值(0.627),與空載組的吸光值(0.124)及不加GTP底物的對(duì)照組的吸光值(0.035)有極顯著性差異P0.01。結(jié)果表明DHAV-1的2A2蛋白具有GTPase的活性。
【關(guān)鍵詞】：鴨甲型肝炎病毒 2A蛋白 功能
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-8
• 縮略詞及符號(hào)說(shuō)明表8-12
• 1 引言12-17
• 1.1 小RNA病毒的蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)12-13
• 1.2 小RNA病毒2A在細(xì)胞中的定位13-14
• 1.3 小RNA病毒2A蛋白的功能研究概況14-16
• 1.3.1 初級(jí)切割病毒編碼的多聚蛋白14
• 1.3.2 2A誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡14-15
• 1.3.3 促進(jìn)病毒RNA的復(fù)制15
• 1.3.4 抑制宿主細(xì)胞蛋白合成15-16
• 1.4 小G蛋白家族的研究概況16
• 1.5 選題的目的和意義16-17
• 2 試驗(yàn)研究17-26
• 2.1 試驗(yàn)材料17-18
• 2.1.1 毒株、菌種及試驗(yàn)動(dòng)物17
• 2.1.2 主要試劑及耗材17
• 2.1.3 血清17-18
• 2.1.4 主要儀器設(shè)備18
• 2.2 方法18-26
• 2.2.1 2A蛋白生物信息學(xué)分析18
• 2.2.2 DHAV-1的2A2、2A3蛋白原核表達(dá)及多克隆抗體制備18-21
• 2.2.3 2A2和2A3蛋白完整性、獨(dú)立性試驗(yàn)21-22
• 2.2.4 2A1的自我剪切試驗(yàn)22-23
• 2.2.5 2A2誘導(dǎo)鴨胚成纖維細(xì)胞凋亡23-25
• 2.2.6 2A2蛋白GTP酶活性試驗(yàn)25-26
• 3 結(jié)果26-52
• 3.1 2A基因的生物信息學(xué)分析26-30
• 3.1.1 DHAV-1多重蛋白質(zhì)序列比對(duì)26-27
• 3.1.2 DHAV-12A蛋白多重蛋白質(zhì)序列比對(duì)27-29
• 3.1.3 DHAV-1的2A2蛋白進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建29
• 3.1.4 DHAV-1的2A2蛋白同源建模29-30
• 3.2 2A2和2A3蛋白的克隆和原核表達(dá)及純化30-37
• 3.2.1 2A2和2A3基因PCR擴(kuò)增30
• 3.2.2 2A2和2A3基因的T克隆及亞克隆30-32
• 3.2.3 2A2和2A3蛋白的表達(dá)及純化32-36
• 3.2.4 2A1、2A2和2A3蛋白的多抗制備36-37
• 3.3 2A2和2A3蛋白是兩種不同的蛋白37-39
• 3.3.1 免疫沉淀試驗(yàn)37-39
• 3.3.2 間接免疫熒光試驗(yàn)39
• 3.4 2A1自我切割試驗(yàn)39-42
• 3.4.1 RFP和RFP-2A1基因的PCR擴(kuò)增39-40
• 3.4.2 重組質(zhì)粒pRFP-EGFP和pRFP-2A1-EGFP的酶切鑒定40
• 3.4.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后熒光的觀察40-41
• 3.4.4 免疫印跡分析41-42
• 3.5 2A2蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡試驗(yàn)42-49
• 3.5.1 構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-2A242-43
• 3.5.2 免疫熒光檢測(cè)2A2蛋白的真核表達(dá)試驗(yàn)43-44
• 3.5.3 真核表達(dá)的2A2蛋白的免疫印跡試驗(yàn)44
• 3.5.4 細(xì)胞形態(tài)的觀察44-45
• 3.5.5 DNA Ladder法檢測(cè)細(xì)胞凋亡45-46
• 3.5.6 細(xì)胞核形態(tài)變化46-47
• 3.5.7 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡47-48
• 3.5.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡48-49
• 3.6 2A2蛋白GTP酶活性測(cè)定49-52
• 3.6.1 2A2蛋白純化49-50
• 3.6.2 磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品的制備50-51
• 3.6.3 酶樣品的測(cè)定51
• 3.6.4 GTP酶活力計(jì)算51-52
• 4 討論52-56
• 4.1 2A蛋白的生物信息學(xué)特性分析52
• 4.2 2A2和2A3蛋白的原核表達(dá)與純化及免疫印跡試驗(yàn)52-53
• 4.3 鼠或兔抗2A1、2A2和2A3蛋白多克隆抗體的制備53
• 4.4 2A2和2A3蛋白完整性、獨(dú)立性試驗(yàn)53-54
• 4.5 2A2蛋白誘導(dǎo)DEF凋亡試驗(yàn)54-55
• 4.6 2A1蛋白的自我切割試驗(yàn)55
• 4.7 2A2蛋白的GTP酶活性試驗(yàn)55-56
• 5 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-64
• 致謝64-65
• 攻讀碩士學(xué)位期間從第一作者身份發(fā)表的文章65

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本文編號(hào)：680991